川芎嗪对成体大鼠脑缺血再灌注损伤后海马齿状回细胞增殖的影响
作者：祁存芳，刘勇，田玉梅，张建水，陈新林，张蓬勃，邱芬，肖新莉，张军峰
【摘要】 目的 研究川芎嗪(tetramethylpyrazine, TMP)对大鼠脑缺血再灌注损伤后海马齿状回(dentate gyrus, DG)细胞增殖的影响。方法 成年雄性SD大鼠行2h大脑中动脉阻塞手术，术后2h开始腹腔注射TMP/[40mg/(kg·d)/]。手术后腹腔注射5?溴脱氧尿核苷(5?bromodeoxyuridine, BrdU)，末次注射24h后处死动物,免疫组化染色观察TMP对脑缺血再灌注损伤后DG细胞增殖的作用。结果 正常组和假手术组在DG有少量BrdU阳性细胞，对照组缺血后1d 阳性细胞开始增加，14d 达到高峰(P<0.05)，TMP组缺血后1d损伤侧BrdU阳性细胞数开始增加，7d达高峰(P<0.05)。结论 TMP能促进缺血再灌注损伤大鼠海马齿状回内源性神经干细胞增殖。
【关键词】 脑缺血再灌注；海马齿状回；细胞增殖；川芎嗪
近年来，成体动物大脑存在神经元再生现象已被公认，神经元再生研究改变了脑损伤不可修复的传统观念。大量实验证明，脑缺血损伤能够刺激成体动物齿状回(dentate gyrus, DG)及侧脑室新生神经元的数目增加,并且这些新生的神经元可从DG颗粒细胞下层迁移至颗粒细胞层,或从侧脑室室管膜下层迁移至嗅球[1?3]。最近的研究还发现急性缺血缺氧脑损伤后内源性神经干细胞的活化可导致海马CA1区锥体细胞的大量再生[4],这些结果已被看作是神经前体细胞增殖并向损伤区域迁移,从而修复脑损伤的证据。川芎嗪(TMP)为中药川芎的提取成份,被广泛应用于心、脑血管闭塞性疾病,研究表明TMP对脑缺血后脑损伤有保护作用[5?6]。但是， TMP是否影响脑缺血再灌注损伤后的神经干细胞增殖还不清楚。本实验观察TMP对成体大鼠脑缺血再灌注损伤后DG细胞增殖的影响,初步探讨脑损伤后神经发生和脑功能自身修复的机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
成年健康、雄性SD大鼠，体重260-300g(西安大学医学院实验动物中心提供)。将动物随机分为TMP治疗组、对照组、假手术组、正常组，TMP治疗组和对照组按缺血后再灌注时间点分为1、3、7、14、21d 5个亚组，每组6只动物。
1.2 药品与试剂
川芎嗪注射液(40mg/2mL，无锡市第七制药厂生产)，5 ?溴脱氧尿嘧啶(BrdU, sigma公司)，大鼠抗BrdU抗体(sigma公司)；SABC试剂盒(武汉Boster公司)，DAB显色剂(sigma公司)，其他试剂均为国产分析纯。
1.3 大脑中动脉阻塞模型制作
采用Zea Longa法[7]制作大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型，并加以改进。选用3.0的单股尼龙手术缝线，将阻塞端灼烧成梭形。按手术步骤暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，从颈外动脉插线，栓塞右侧大脑中动脉。线栓深度距颈总动脉分叉约(17.0±1.5)mm，假手术组除不插线外其他步骤相同。线栓保留2h后，小心拔除至颈总动脉分叉处恢复血流。观察模型大鼠清醒后的行为学改变，按Zea Longa五级四分法评定动物神经功能，本实验将第1、2、3级大鼠确定为成功模型。
1.4 BrdU标记及TMP给药方法
根据报道[8]，将BrdU溶于生理盐水中配制成10g/L的溶液，处死动物前1d腹腔注射(50mg/kg)，隔4h 1次，共3次。TMP治疗：术后2h开始TMP腹腔给药(40mg/kg)，1次/d，至处死动物前1d。正常组、假手术组、对照组给予等量生理盐水注射。
1.5 神经功能缺失体征评分
Zea?Longa的方法在大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO) 术后不同时间点用单盲法进行5分制评分。0分：无明显神经病学症状；1分：不能完全伸展左侧前爪；2分：向左侧旋转；3分：行走时向左侧倾倒；4分：不能自行行走。
1.6 BrdU免疫组化染色
大鼠经心脏灌注法固定后，取出脑组织，置40g/L多聚甲醛(pH7.6)中固定过夜，切取距前囟-2.4mm、-5.6mm冠状位脑块，石蜡包埋。自前向后行石蜡切片，片厚6μm，隔99取2，每个脑共取10张切片行免疫组化染色。简要步骤如下：切片常规脱蜡、复水，微波加热修复抗原，3%(体积分数)H2O2处理，1%(体积分数)Triton×100处理30min，2mol/L HCl变性处理30min，正常牛血清封闭后用大鼠抗BrdU抗体(1∶1000)4℃下湿盒内孵育24h；生物素化羊抗大鼠IgG抗体(1∶100)室温2h；复合SABC工作液室温30min；各步骤之间用0.01mol/L PBS冲洗，DAB显色，常规脱水、透明、封片。
1.7 细胞计数方法
每只大鼠随机选取6张非连续的脑片，用Motic图像分析系统对两侧海马齿状回BrdU阳性细胞进行计数，在高倍镜下计数不重复4个视野 BrdU阳性细胞数，取平均值。
1.8 统计学处理
所获数据用SPSS10.0统计软件进行oneway ANOVA LSD方差分析，以±s表示，取P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 神经功能缺失评分结果
动物造模后大多存活，并有神经功能缺失体征，而假手术组未见神经功能缺失体征。对照组和TMP治疗组神功能评分随时间延续平行下降，即缺血损伤后4、8h神经功能评分高于损伤后7d(P<0.05)，对照组于缺血损伤后1d神经功能评分高于TMP治疗组(P<0.05)，其余时间点无统计学差异(表1)。
2.2 BrdU免疫组化染色结果
BrdU阳性细胞胞核深染，呈棕黄色、褐色，齿状回颗粒细胞层(granular cell layer, GCL)、颗粒细胞下层(subgranular zone, SGZ)均有阳性细胞分布，主要分布在SGZ，呈丛集或分散分布(图1)。假手术组与正常组DG可见1-2个BrdU阳性细胞。对照组缺血后1d损伤侧海马齿状回BrdU阳性细胞数无显著变化，7d损伤侧BrdU阳性细胞数开始增加，并于14d达高峰；损伤对侧BrdU阳性细胞数1-7d无明显变化，14d BrdU阳性细胞数明显增加，21d开始下降。TMP组缺血后1d损伤侧BrdU阳性细胞数开始增加，7d达高峰(P<0.05)，而对侧BrdU阳性细胞数变化不明显(图2)。表1 成体大鼠脑缺血再灌注损伤后不同时间神经功能缺失评分（略）
3 讨 论
BrdU是胸腺嘧啶脱氧核苷类似物, 在细胞增殖周期的S期嵌入细胞核的DNA，BrdU常被作为一种检测增殖细胞数量变化的标记物，同时也作为神经干细胞的间接标志物，用免疫组织化学方法可以显示神经干细胞的增殖情况[9]。大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能学评分可以反映脑缺血后神经功能损伤程度。本研究结果显示缺血损伤早期大鼠神经功能缺失明显，而损伤后7d大鼠神经功能缺失症状明显好转，说明缺血再灌注损伤后大鼠自身有部分功能得以修复。而TMP治疗组除1d外，虽较缺血对照组同时间点神经功能评分有所降低，但无统计学差异。结合我们同期不同剂量TMP对缺血再灌注损伤神经功能评分的实验结果分析，可能由于给药剂量较小，血药浓度较低有关。研究表明，缺血、缺氧、外伤、癫痫等多种原因所致的脑损伤均可诱导成体动物脑内海马齿状回神经发生的水平上调。研究证实缺血再灌注损伤后成体大鼠脑内海马齿状回神经发生在一定时间窗内增强。本实验结果显示，在正常成体大鼠脑组织DG仅有少量BrdU阳性细胞。脑缺血再灌注损伤后DG BrdU阳性细胞数目增加，14d达到高峰，这与Zhang等[8]的结果相同。与Jin等[3]结果相同，在缺血再灌注损伤后损伤对侧DG也有BrdU免疫阳性细胞表达，14d时BrdU阳性细胞数明显增多。TMP治疗组在损伤侧，3d和7d BrdU阳性细胞显著高于对照组，细胞增殖高峰明显提前，而且14d后仍维持高水平。上述结果提示，缺血再灌注损伤后海马齿状回神经细胞增殖，TMP能促进DG神经细胞增殖，并在一定时间窗内增强，这为临床治疗可以早期给药提供理论基础。研究发现缺血性脑损伤后成体海马齿状回神经前体细胞增殖水平的改变与包括谷氨酸受体、一氧化氮(NO)以及神经营养因子表达在内的多种调控因素密切相关[10?12]。 川芎嗪注射液能通过血脑屏障，是一种钙离子拮抗剂及自由基清除剂，可阻止钙离子向细胞内转移，对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。而大量的实验及临床研究业已证明TMP具有减轻脑缺血后迟发性神经元损伤和海马区神经元水肿,拮抗兴奋性氨基酸毒性以及促进再灌注后期NO产生等广泛的生物学活性[13?14]。成体脑组织在缺血再灌注损伤后齿状回神经发生水平的上调与脑损伤后N?甲基?D?天门冬氨酸(NMDA)受体的激活密切相关。NMDA受体的许多生理作用均通过NO介导。成体脑缺血再灌注损伤大鼠给予TMP治疗后发现其齿状回BrdU阳性细胞数量较对照组和假手术组明显增加，表明TMP促进缺血性脑损伤后海马齿状回细胞增殖。其机制可能与TMP能够影响缺血性脑损伤后兴奋性氨基酸NMDA受体作用通路中的谷氨酸代谢和NOS NO通路中不同时相产生的NO等多种因素有关。
【】
/[1/]Zhu DY, Liu SH, Sun HS, et al. Expression of inducible nitric oxide synthase after focal cerebral ischemia stimulates neurogenesis in the adult rodent dentate gyrus /[J/]. Neuroscience, 2003,23:223?229.
/[2/]Wang WD, Jiang W, Wang HD, et al. Study of neurogenesis in dentate gyrus after global ischemia reperfusion in rats /[J/]. J Fourth Mil Med Univ, 2002, 23(8):673?677.
/[3/]Jin K, Mimami M, Lan J Q, et al. Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat /[J/]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98:4710?4715.
/[4/]Park KI, Hack MA, Ourednik J, et al. Acute injury directs the migration, proliferation, and differentiation of solidorgan stem cells: evidence from the effect of hypoxia ischemia in the CNS on clonal ?reporter? neural stem cells /[J/]. Exp Neurol, 2006, 199:156?178.
/[5/]Liao SL, Kao TK, Chen WY, et al. Tetramethylpyrazine reduces ischemic brain injury in rats /[J/]. Neurosci Lett, 2004, 372(30):40?45.
/[6/]赵建军，刘勇，陈新林，等. 川芎嗪对大鼠局部脑缺血后空间学习和记忆的影响 /[J/]. 西安大学学报(医学版), 2006, 27(2):127?131.
/[7/]Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats /[J/]. Stroke, 1989, 20(1):84?91.
/[8/]Zhang RL, Zhang ZG, Zhang L, et al. Proliferation and differentiation of progenitor cells in the cortex and the subventricular zone in the adult rat after focal cerebral ischemia /[J/]. Neuroscience, 2001,105(1):33?41.
/[9/]Ciaroni S, Cecchini T, Ferri P, et al. Impairment of neural precursor proliferation increases survival of cell progeny in the adult rat dentate gyrus /[J/]. Mech Aging Dev, 2002, 123(10):1341?1352.
/[10/]Contestabile A, Ciani E. Role of nitric oxide in the regulation of neuronal proliferation, survival and differentiation /[J/]. Neurochem Int, 2004, 45(6):903?914.
/[11/]Park C, Kang M, Kwon YK, et al. Inhibition of neuronal nitric oxide synthase enhances cell proliferation in the dentate gyrus of the adrenalectomized rat /[J/]. Neurosci Lett, 2001, 309(1):9?12.
/[12/]Zhu DY, Lau L, Liu SH, et al. Activation of cAMP?response?element?binding p rotein (CREB) after focal cerebral ischemia stimulates neurogenesis in the adult dentate gyrus /[J/]. PNAS, 2004, 101:9453?9457.
/[13/]林海,刘煜. 局灶性脑缺血再灌注后海马CA1区超微结构改变及川芎嗪的保护作用 /[J/]. 全科医学, 2004,7(17):1216?1218.
/[14/]李盈，严 英，周伟生. 川芎嗪防治缺血再灌注损伤作用机理的研究进展 /[J/]. 中药新药与临床药理,2005,16(6):464?466.
