P16基因甲基化与淋巴细胞?浆细胞肿瘤的发生发展
【摘要】 基因启动子区CpG岛甲基化常导致基因沉默。P16基因是一定位于9p21的多种肿瘤抑制基因，通过pl6INK4A?cyclin D1-PRb通路维持机体细胞的有序增殖。P16基因甲基化在淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤等多种淋巴细胞?浆细胞肿瘤中被检测到，并与疾病的发生、存在一定关系，应用甲基化抑制因子或砷剂去甲基化，恢复基因功能可望成为血液恶性肿瘤治疗的一种新手段。本文就P16基因甲基化机制及P16基因甲基化与淋巴细胞?浆细胞肿瘤（淋巴瘤、急性和慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓病）的关系作一综述。
【关键词】 淋巴瘤
Methylation of P16 Gene with Pathogenesis of Lymphocytic and Plasmacytic Malignancies ——Review
Abstract Methylation of CpG islands in the promoters induces gene silencing. The multiple tumor suppressor gene P16, located at chromosome 9p21, regulating normal proliferation of cells with a functional unit constituting of p16, cyclin D1 and pRb together. Methylation of P16 gene has been detected in several lymphocytic and plasmacytic malignancies such as lymphoma, acute lymphocytic leukemia and multiple myeloma and shows relationships with the pathogenesis of these diseases. Application of demethylation agents or arsenical to refresh the gene functions will be expected to be a new treatment for hemopoietic malignancies. In this article, methylation mechanism of P16 gene and relationship of P16 gene methylation with lymphocytic and plasmacytic malignancies, such as lymphoma, acute and chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma were reviewed.
Key words P16 gene; lymphoma; multiple myeloma; methylation; plasmacytic malignancy
P16基因又称INK4A ，是一克隆和定位于9p21的多种肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor gene， MTS1)，基因产物P16蛋白属细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂(cyclin?dependent kinase inhibitor， CDKI）家族，在细胞增殖周期调控中发挥重要作用。近年来研究发现，P16基因甲基化与人类多种肿瘤，如结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤及白血病淋巴瘤等关系密切，现就P16基因甲基化与人类淋巴细胞?浆细胞肿瘤的发生发展作一综述。
P16基因概述
基因P16（INK4A）首先由Kamb等于1994年在290余种肿瘤细胞系染色体9p21上被发现。该基因全长8.5 kb，包括3个外显子E1、E2、E3，共同编码相对分子量16 kD的蛋白质即P16蛋白。
野生型P16蛋白含148个氨基酸，调控细胞生长的结构基础为4个回钩状重叠序列，该结构域结合于周期蛋白依赖激酶（cyclin?dependent kinase CDK）上远离周期蛋白D（cyclin D）的位点，与cyclin D竞争结合CDK4／CDK6 或与cyclin D／CDK4／CDK6复合物结合，抑制复合物的形成或其活性，并进一步阻止视网膜母细胞瘤易感基因产物PRb的磷酸化，使后者与转录因子E2F结合，抑制转录，细胞停滞于G1期，以维持机体细胞的有序增殖，由p16INK4A、cyclin D1、PRb参与的调控途径被称为pl6INK4A?cyclin D1一PRb通路［1］。
细胞周期中存在G1／S检查点(checkpoint)，通过监测细胞分子损伤，控制细胞周期进展速度，确保周期转换的正确性。体外细胞研究发现，人纤维母细胞凋亡时P16表达呈高水平，经ras癌基因转导 的人纤维母细胞同样表现出P16水平的升高和细胞早衰，提示野生型P16基因具有促细胞衰老凋亡的作用。小鼠实验也发现，P16蛋白异常可导致G1／S检查点功能低下，细胞周期调节失控，病态DNA复制，细胞呈自主的、无限制性增殖，导致细胞永生化，增加缺陷小鼠对肿瘤的易感性。
P16基因甲基化通常发生在5' 端上游启动子距外显子约0.5-2.0 kb富含CpG岛（CGI）的区域。Gonzalez等［2］研究表明， p16基因在不同患者、不同组织、肿瘤发展的不同阶段，甲基化的位点和频率都不尽相同，可能与不同组织细胞代谢水平、分裂水平不同有关。
在基因启动子区，CpG二核苷酸簇集出现，富含GC，大小为100-1 000 bp，称为CGI，该区具有潜在的转录活性。人类基因组中，多数持家基因含CGI，人成熟细胞中70 %基因CGI二核苷酸胞嘧啶环5位有甲基化修饰（甲基化CpG）。这种修饰一般发生在CGI以外的散在结构上，而具有转录活性的基因启动子区CGI则大多呈现去甲基化状态。
目前甲基化被认为是脊椎动物DNA化学修饰的唯一方式——在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase DNMT)催化作用下，以S?腺苷甲硫氨酸为甲基供体，介导胞嘧啶转变为5?甲基胞嘧啶。体外实验证实，半甲基化DNA是DNMT的特异性底物，DNMT活性增强使敏感的CGI位点发生时间依赖的从头甲基化，DNA转录活性同基因甲基化状态和甲基化程度密切相关。在肿瘤性疾病早期即可观察到有CGI甲基化现象：肿瘤组织中DNA普遍低甲基化主要发生在与细胞凋亡密切相关的基因，如： bcl ?2，c?myc等，异常过甲基化则通常发生于富含CGI的MTS1的启动子区。
早在上世纪90年代Baylin等发现CGI甲基化可稳定x染色体的转录抑制状态，去甲基化则是基因表达的开放结构，利于基因高表达，应用甲基化抑制因子5?氮胞苷（DAC）可使失活的x染色体重新激活。以下3种机制可能解释CGI甲基化导致的基因转录关闭： ①转录识别区胞嘧啶核苷酸甲基化阻遏后续特异性转录蛋白的结合，直接或间接干扰基因转录装置，导致基因沉默（gene silencing）；② 甲基化DNA与特异性转录阻遏物(repressor)或称CpG甲基化结合蛋白?1（ MeCP1）结合，形成10?甲基化?CpGs抑制转录 ［3］ ；③基因编码区CGI甲基化还可能导致脱氨基作用或修复障碍，影响染色质结构，或通过招募染色体组蛋白乙酰基转移酶活化及甲基化CpG结合蛋白?2(MeCP2)，低甲基化基因CpG而减少基因转录［4］，尚可以通过影响组蛋白H1及核小体的稳定性减少基因转录，目前认为启动子区DNA甲基化与组蛋白去乙酰化之间具有协同抑制基因转录的作用。
P16基因甲基化与淋巴细胞?浆细胞肿瘤的关系
P16基因甲基化与淋巴瘤
pl6INK4A?cyclin D1一PRb通路的活化是细胞周期G1/S期跃迁的主要调节途径之一。目前普遍认为，P16基因甲基化在淋巴瘤中阳性率较白血病中为高，且基因甲基化与疾病发生发展密切相关。P16基因在多数低度恶性淋巴瘤细胞株，如滤泡细胞型（FL）或黏膜相关型淋巴瘤（MALT）细胞株中表达正常，而>50%的恶性程度较高的淋巴瘤细胞株中表达呈完全缺失或部分缺失，无论淋巴瘤组织类型恶性程度高低，获得性MTS1的改变可导致肿瘤发展为高度侵袭性，发生P16基因甲基化的套细胞淋巴型非霍奇金淋巴瘤（NHL）—— MCL亚型临床行为常表现为肿瘤的高增殖活性和侵袭性，患者易发生耐药。基因甲基化还是大B细胞型淋巴瘤（LBCL）患者P16基因表达缺失的主要机制，甲基化尚与MTS1p53的突变及p27KIP1基因的失活呈协同作用［5］。
Macia等［6］对53名CD30+的NHL患者（其中间变性大细胞型25例，外周性T细胞型13例，间变性弥漫大B细胞型15例）和26名霍奇金淋巴瘤（HD）患者应用甲基化特异性PCR（MSP）检测P16基因甲基化位点，发现28%的NHL患者（其中B型间变性大细胞型占50%， T型间变性大细胞型占15%，外周性T细胞型占23%，间变性弥漫大B细胞型占27%）和38% 的HD患者存在P16基因甲基化，并发现基因甲基化与疾病类型及发展阶段相关，P16基因甲基化在NHL初诊患者中占27%，复发患者中占31%，两者未存在明显差异。在HD初诊患者中仅占25%，而在复发患者中比例高达83%。这提示P16基因甲基化在NHL患者属早期事件，而HD患者一般在疾病进展期才被检测到。
Arbiser 等［7］研究发现，P16基因过甲基化与EB病毒感染相关的Burkitt 淋巴瘤（BL）密切相关。Blum等［8］也认为，BL患者细胞存在P16基因、死亡相关蛋白(DAP) 甲基化及 Myc/Max异二聚体、组蛋白乙酰基转移酶之间的相互作用，基因甲基化修饰是BL发生发展中的重要事件，并可作为DNA甲基转移酶抑制剂如，脱氧氮杂胞苷、5?氮杂胞苷的BL治疗靶点。
Herranz等［9］应用小鼠大胸腺T淋巴瘤模型在对甲基化抑制药物Zebularine的研究发现，未治疗组大胸腺T淋巴瘤小鼠生存期一般为4-5.5个月，而Zebularine治疗组小鼠生存期均超过1年，且未发现明显毒副作用发生，推测甲基化抑制药物有明显的抗肿瘤活性和临床应用的安全性。
P16基因甲基化与急性淋巴细胞性白血病（ALL）
P16基因甲基化在髓细胞性白血病患者中阳性率不高，与疾病发生关系较小，仅在慢性髓系白血病（CML）急变时阳性率明显增高，而与急性淋巴细胞性白血病（ALL） 的发生发展存在一定关系，尤以成人T细胞性白血病(ATL)患者中阳性率较高。
Trovato等［10］对人T细胞白血病?淋巴瘤病毒?1（HTLV?1）感染的T细胞株和14名急性成人T淋巴细胞性白血病（ATLL）患者细胞离体检测，发现P16基因是HTLV?1感染的整合靶点。Nosaka等［11］对不同类型ATL P16基因甲基化的研究也发现，甲基化与ATL的发生发展关系密切。甲基化频率在急性ATL，淋巴瘤型ATL，慢性ATL及惰性ATL患者原代细胞中分别为47%、73%、17%、17%，且发现在24例基因甲基化病例中，17例甲基化发生在启动子和外显子区，7例仅发生在外显子区，尚有1例甲基化类型均不同于其他，这些结果提示基因甲基化尚存在多种亚克隆形式。
Garcia?Manero等［12］对25例初诊及第一次复发的成人ALL进行P16基因甲基化检测发现，80%患者存在P16基因甲基化，包括1例初诊病例和6名复发患者(p = 0.0001)，并在这6名患者中发现其中3名合并存在新发P15基因甲基化。作者认为，P16基因甲基化虽然可能不是成人白血病细胞恶性转化的主要机制，且与疾病临床特点、疾病缓解率（CR）、第二次复发及总生存率（OS）均无明显相关性，但基因甲基化在复发病人中比率极高，且基因甲基化程度似乎与疾病进展相关，因此推测P16基因甲基化可以作为监测判断成人ALL预后的一项重要指标。
P16基因甲基化与慢性淋巴细胞性白血病
Tsirigotis 等［13］检测34例慢性淋巴细胞性白血病（CLL）患者P16基因甲基化状态发现，基因甲基化在CLL病人中发生频率较其他淋系肿瘤明显降低（17.6%，6/34），基因甲基化与CLL疾病发生发展的意义尚待进一步研究。
P16基因甲基化与多发性骨髓瘤
多数学者认为，P16基因甲基化在多发性骨髓病（MM）疾病早期即是一个普遍事件，但目前尚不能确定基因甲基化对疾病发生发展的具体影响机制。
Gonzalez?Paz等［14］对17名意义未明单克隆免疫球蛋白血症（MGUS）患者，40名孤立型骨髓瘤（SMM）患者及522名MM 患者P16基因甲基化情况研究结果显示，患者中P16基因甲基化频率分别为24%, 28% 和34%，基因甲基化病例多伴染色体17p13.1 MTS1 p53位点缺失，但尚不能确定基因甲基化对浆细胞生长周期是否存在明显影响，且对439名MM患者的长期随访结果也未提示基因甲基化与总生存率（OS）之间的明确联系。 Guillerm等［15］临床研究发现，P16基因甲基化易发生在CD?138阳性病人肿瘤细胞中，在疾病早期MGUS、MM病人、疾病复发阶段或难治病例中均可出现，但甲基化状态和程度与患者性别、年龄、疾病种类、M?蛋白含量均未发现明显相关。Ribas等［16］的临床试验也未发现基因甲基化同MM血管发生及血管源性生长因子（VEGF）表达的明显相关性，推测P16基因甲基化可能仅作为浆细胞肿瘤整体表观遗传学改变及疾病进展的一个标志，而与疾病发生发展的生物学特性及临床表现无直接相关性。
Li等［5］应用三氧化二砷(As2O3) 1.0 mmol/L 和2.0 mmol/L分别作用于MM U266细胞株发现，野生型U266细胞株普遍存在P16基因过甲基化， As2O3可诱导P16基因的再表达且作用呈剂量依赖性，砷剂摄入体内，在肝脏内被还原发生甲基化，砷剂代谢所需的甲基来自S?腺苷甲硫氨酸，与含巯基酶结合后，抑制酶的活性，干扰酶的生理功能。从而作者推测砷剂去甲基化作用的可能机制： ① 通过竞争甲基引起细胞内缺甲基状态；② 选择性抑制DNMT，维持去甲基化状态。
展 望
P16基因及其他MTS1，如DNA修复基因hMLH1、前凋亡基因DAPK、细胞因子信号抑制因子SOCS基因等甲基化改变是血液恶性肿瘤发生发展中的重要事件。肿瘤抑制基因的发现、基因甲基化机制的深入研究以及甲基化抑制因子去甲基化的临床应用，不但有助于人类进一步揭示临床恶性血液肿瘤发生发展的机制，也为今后肿瘤微小残留病灶（MRD）的检测、肿瘤治疗提供新的手段和策略。随着人类基因组计划的完成和后基因组时代的到来，关于肿瘤抑制基因越来越多的奥秘正等待着我们的探索。
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