COX?2在慢性白血病骨髓细胞中的表达及其意义
作者：鲍振华， 李广伦 于军红
【摘要】 本研究探讨慢性白血病患者骨髓细胞COX?2的表达水平及其作用机制和意义。 采用Western blot方法检测了67例慢性白血病患者骨髓细胞COX?2及内参照β?actin的表达水平，以14名健康供者骨髓为阴性对照。 结果表明： CML?CP组COX?2的阳性表达率为76.32％(29/38),高于对照组，有显著统计学意义(p=0.0000),CLL组COX?2的阳性表达率为75.86％(22/29),高于对照组,有显著统计学意义（p=0.0000）。COX?2在CML?CP组和CLL组的表达水平差别无统计学意义（p>0.05）。COX?2阳性组LDH水平高于COX?2阴性组，差别有统计学意义(p<0.001)。 结论： 在慢性髓系白血病慢性期和慢性淋巴细胞白血病中均表达COX?2,而且LDH水平也偏高。
【关键词】 慢性白血病
Expression of Cyclooxygenase?2 in Bone Marrow Cells of Chronic Leukemia and Its Significance
Abstract The study was aimed to investigate the expression of COX?2 in bone marrow cells of chronic leukemia patients and its potential pathogenetic implications. Western blot was applied for detecting COX?2 expression levels in bone marrow cells of 67 chronic leukemia patients and β?actin expression levels. Bone marrow aspirations from 14 healthy donors were used as negative controls. The results showed that the positive rates of COX?2 in chronic?phase group of chronic myeloid leukemia (CML?CP) and in group of chronic lymphocytic leukemia (CLL) were 76.32％(29/38) and 75.86％(22/29) respectively. Both CML?CP and CLL group showed a higher expression than control group (p=0.0000,p=0.0000 respectively). The expression of LDH in Cox?2 positive group was higher than that in Cox?2 negative group, and the difference between the two groups was statistically significant (p<0.001). It is concluded that the expression of COX?2 protein can be detected in bone marrow cells of CML?CP and CLL and the expression level of LDH were higher in cells of CML?CP and CLL. The expression of COX?2 may be correlated with prognosis of CML?CP and CLL.
Key words cyclooxygenase?2; chronic leukemia; pathogenesis
环加氧酶(cyclooxygenase, COX)是参与花生四烯酸的环氧酶代谢途径中的限速酶,可催化花生四烯酸转化为前列腺素(prostaglandins, PG)。目前发现哺乳动物的COX至少有两种异构酶COX?1和COX?2。COX?1是一种结构型酶，是正常细胞的组成蛋白，参与多种生理过程,如保护胃肠道黏膜细胞、调整肾脏血流和控制血小板聚集等。COX?2是一种诱导型酶,在正常生理情况下仅少数组织如前列腺、子宫等内有少量表达。但在细胞因子、内皮细胞生长因子、炎症介质、促肿瘤剂以及癌基因产物等的刺激下COX?2可发生诱导性表达。近年来对COX?2的研究表明，在直肠癌、胃癌、肺癌等一些实体肿瘤中存在COX?2过度表达现象，提示COX?2可能与肿瘤的发生密切相关。而COX?2与血液系统疾病的相关性也受到越来越多的重视。我们收集了67例慢性白血病患者的骨髓，检测了COX?2的表达水平，并探讨其在白血病中的作用机理及意义。
病例和方法
病例来源
67例慢性白血病病人均为青岛大学医学院附属血液科住院部及门诊病人，其中慢性髓系白血病慢性期（CML?CP）38例，慢性淋巴细胞白血病（CLL）29例，后者按照欧洲Binet临床常用CLL分期标准［1］A期患者12例，B、C期患者共17例。以4例健康供者为阴性对照。67例白血病患者中，男40例，女27例，中位年龄58.2（42-73）岁。白血病的诊断均经临床、血常规检查、骨髓象及组织化学染色、免疫分型、染色体检查确诊，部分患者行融合基因检测，符合白血病形态学、免疫学、细胞遗传学（MIC）分型。
抽取病人骨髓2 ml，分离单个核细胞，加入放射免疫沉淀测定（RIPA）裂解液，离心提取蛋白，按BCA法进行蛋白定量。
COX?2蛋白表达的Western blot 检测
将裂解蛋白(每孔100 μg)进行100 g/L的SDS?PAGE电泳，然后电转移至PVDF膜上。用5％的脱脂牛奶封闭4℃冰箱过夜。次日加兔抗人COX?2（1∶1 000）多克隆抗体（购自NewMarker公司），室温下作用2小时，洗涤后加辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG（1∶5 000），最后用ECL试剂盒检测信号，用bandscan V5.0软件对其灰度进行相对定量分析。
统计学处理
数据均以±SD表示，应用SPSS 11.0 统计软件进行处理, 两组资料间均数比较采用t检验，计数资料用χ2检验,以p<0.05为差异有统计学意义。
结 果
COX?2在CLL骨髓细胞中的表达
COX?2在CLL组的阳性表达为75.86％(22/29)，与对照组比较差别有显著统计学意义（p＝0.0000）。据Binet分期，22例COX?2+患者中A期6例(27.27%)，B、C期共16例(72.73%)；在7例COX?2-患者中A期6例(85.71%)，C期1例(14.29%)。12例A期患者中50％COX?2+(6/12),50% COX?2-(6/12)；17例B、C期患者中94.12％COX?2+(16/17)，5.88％COX?2-(1/17)。COX?2+在Binet A期和Binet B+C期间有显著差异(p<0.05),提示COX?2与预后可能相关(表1)。
COX?2在CML骨髓细胞中的表达
38例CML患者，其中29例表达COX?2，9例不表达，与对照组比较有显著统计学意义（p＝0.0000）。Western blot检测CML和CLL病人骨髓细胞COX?2表达（图1）。
COX?2与临床参数
51例COX?2阳性表达患者中WBC>50×109/L的25例，平均为52.06×109/L；血红蛋白平均为99 g/L；血小板计数平均为173×109/L。乳酸脱氢酶平均为344 U/L。在以上临床指标中，仅仅乳酸脱氢酶在COX?2阳性表达组和阴性表达组之间的差别有统计学意义(t=2.1684，p<0.05 )（表2），提示COX?2可能与预后相关。
讨 论
COX?2是一种具有氧化和过氧化双重功能的酶。COX?2可由各种细胞因子诱导而表达，白血病细胞中COX?2表达的上调可能是由细胞因子通过自分泌的方式诱导表达的。研究结果显示，在慢性粒细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病中均有COX?2表达，这与以往认为在B系淋巴细胞中不表达COX?2而只在髓系细胞中表达的结论是相反的，这一结果扩展了以往对COX?2只在实体肿瘤中高表达的认识，并且有利于进行靶向［2-4］。Wun等［5］研究发现，原始B淋巴细胞COX?2的表达率极低，可能只在一些特定的淋巴细胞亚群中存在COX?2的高表达。
CML病人的骨髓中血管生成显著增多［6］。Aguayo等［7］研究发现，COX?2可以促进骨髓血管生成，增加血管生成因子包括VEGF、bFGF、TGF?b和IL?6的水平；VEGF在慢性粒细胞白血病中的水平远高于AML、MDS、ALL、CLL。COX?2,VEGF与类花生酸类物质的生成密切相关，尤其是PG，PGE2可以诱导IL?6和结合珠蛋白表达，而IL?6和结合珠蛋白是血管生成的重要调节因子［8］。关于COX?2高表达能够抑制凋亡的机制已有许多假说，包括上调bcl?2的表达［9］。Bcl?2蛋白主要生物学功能为抑制细胞凋亡，延长细胞寿命，增加细胞对各种凋亡刺激因素的抗性。动物实验已经证实，COX?2基因表达及其产物PGE2能够促进凋亡抑制基因bcl?2的表达并引起细胞凋亡减少［10,11］。由此可以推论，COX?2在CML中的作用机理可能是通过VEGF等的作用促进PG的生成，从而使血管增生，抑制细胞凋亡。
虽然我们不能确定COX?2是否是CLL的主要发病机制，但很可能与许多实体肿瘤一样，过度表达的COX?2在CLL的发病机制中发挥了重要的作用。B?CLL细胞所表达的COX?2具有酶的活性，能够催化细胞产生PGE2和PGF2α［12］。PGE2是一种重要的宿主免疫调节因子，它能够减少由巨噬细胞和杀伤细胞所产生的IL?12和IFNγ，IL?12和IFNγ是Th1型细胞因子即辅助细胞免疫的细胞因子［13,14］。此外，PGE2还能增加基质金属蛋白酶的活性，血管通透性和血管舒张［15］。也就是说，B?CLL细胞所产生的PGE2将导致免疫监视的损害，从而促使疾病的进一步。Ryan等［12］证实B?CLL细胞能够产生TXA2，COX?2在产生TXA2的过程中发挥了重要的作用。增加的TXA2产物通过增强血管内皮细胞黏附分子的表达和影响血小板功能来促进B?CLL的进一步发展［16］。徐卫等［17］研究发现bcl?2在CLL中表达，且与疾病的进展无关。由此我们推论，COX?2在慢性淋巴细胞白血病中高表达的作用机制可能与其上调PG、TXA2等产物的表达及抑制凋亡有关。
结果显示，CLL组COX?2阳性表达率B、C期患者(94.12%)明显高于A期患者(50%)，二者之间的差别有统计学意义；COX?2阳性组的LDH(358.96±99.03 IU/L)明显高于阴性组(295.25±113.44 IU/L)，其差别有显著统计学意义。临床分期及血清学指标是影响CLL预后的相关因素，Binet A期是预后的低危因素，Binet B、C期及LDH等血清学指标增高是预后的高危因素［18］，以上结果均提示COX?2可能与预后呈负相关。这与Giles［6］等、Ryan等［12］证实的在CML中COX?2高表达提示预后不良，在B?CLL中COX?2对判断预后有一定意义的观察结果是一致的。COX?2与预后的相关性仍在随访中，需长期观察以明确其预后价值。COX?2是否与白血病的恶性浸润有关，目前对此仍未确定。COX?2在慢性白血病中高表达，促使我们去进一步研究选择性COX?2抑制剂在慢性白血病中的应用价值。
【】
1Binet JL, Auquier A, Dighiero G, et al. A new prognostic classification of chronic lymphocytic leukemia derived from a multivariate survival analysis. Cancer, 1981; 48:198-206
2Dannenberg AJ, Subbaramaiah K. Targeting cyclooxygenase?2 in human neoplasia: rationale and promise. Cancer Cell, 2003; 4:431-436
3Gasparini G, Longo R, Sarmiento R, et al. Inhibitors of cyclooxygenase 2: a new class of anticancer agents? Lancer Oncol, 2003; 4:605-615
4Subbaramaiah K, Dannenberg AJ. Cyclooxygenase 2: a molecular targer for cancer prevention and treatment. Trends Pharmacol Sci, 2003; 24:96-102
5Wun T, Mcknight H, Tuscano JM. Increased cyclooxygenase?2(COX?2): a potential role in the pathogenesis of lymphoma. Leuk Res, 2004; 28:179-190
6Giles FJ, Kantarjian HM, Bekele BN, et al. Bone marrow cyclooxygenase?2 levels are elevated in chronic?phase chronic myeloid leukaemia and are associated with reduced survival. Br J Haematol, 2002; 119:38-45
7Aguayo A, Kantarjian H, Manshouri T, et al. Angiogenesis in acute and chronic leukemias and myelodysplastic syndromes. Blood, 2000; 96:2240-2245
8Fosslien E. Biochemistry of cyclooxygenase (COX)?2 inhibitors and molecular pathology of COX?2 in neoplasia. Crit Rev Clin Lab Sci, 2000; 37:431-502
9Liu XH,Yao S, Kirschenbaum A, et al. NS398, a selective cyclo? oxygenase ?2 inhibitor, induces apoptosis and down?regulates bcl?2 expression in LNCaP cells. Cancer Res, 1998; 58:4245-4249
10Tsujii M, Kawano S, DuBois RN. Cyclooxygenase?2 expression in human colon cancer cells increases metastatic potential. Proc Natl Acad Sci USA,1997; 94:3336-3340
11Sheng H, Shao J, Morrow JD, et al. Modulation of apoptosis and bcl?2 expression by prostaglandin E2 in human colon cancer cells. Cancer Res, 1998; 58:362-366
12Ryan EP, Pollock SJ, Kaur K, et al.Constitutive and activation?inducible cyclooxygenase?2 expression enhances survival of chronic lymphocytic leukemia B cells. Clin Immunol, 2006; 120:76-90
13Walker W, Rotondo D. Prostaglandin E2 is a potent regulator of interleukin?12? and interleukin?18?induced natural killer cell interferon?gamma synthesis. Immunology, 2004;111:298-305
14Wittmann M, Larsson VA, Schmidt P, et al. Suppression of interleukin?12 production by human monocytes after preincubation with lipopolysaccharide. Blood, 1999; 94:1717-1726
15Wagenaar?Miller RA, Hanley G, Shattuck?Brandt R, et al. Cooperative effects of matrix metalloproteinase and cyclooxygenase?2 inhibition on intestinal adenoma reduction, Br J Cancer, 2003; 88:1445-1452
16Mitsuhashi M, Tanaka A, Fujisawa C, et al. Necessity of thromboxane A2 for initiation of platelet?mediated contact sensitivity: dual activation of platelets and vascular endothelial cells. J Immunol, 2001;166: 617- 623
17徐卫，李建勇，吴雨洁等. 29例慢性淋巴细胞白血病Ki?67和Bcl?2的表达及临床意义. 实验血液学杂志，2006; 14:464-467
18Oscier D, Fegan C, Hillman P, et al （孙蕾译）. 慢性淋巴细胞白血病诊治指南. 国外医学·输血及血液学分册，2005； 28:1-7
