A20在前列腺癌细胞中的表达
作者：闰玮, 刘家云, 苏明权, 李晓瑾, 郝晓柯
【关键词】 A20;,锌指蛋白;,前列腺癌
[摘 要] 目的: 探讨A20（肿瘤坏死因子可诱导的初级应答基因）在前列腺癌各细胞系中的表达及意义。方法: RTPCR检测体外培养的前列腺癌细胞PC3, PC3M, Du145, LNcap和22RV1中A20 mRNA的表达, Western blot检测A20蛋白质(锌指蛋白A20)的表达。结果: RTPCR和Western blot检测显示A20在前列腺癌5种细胞系中均表达, 但表达水平有差别, 在PC3和PC3M细胞中A20在mRNA和蛋白质表达水平均显著高于其余3种细胞系(P<001)。结论: A20在各前列腺癌细胞系中的表达不尽相同, 对A20表达的研究对于下一步研究该基因在前列腺癌发生中的作用有重要意义。
[关键词]A20; 锌指蛋白; 前列腺癌
A20基因最初是在人脐静脉血管上皮细胞中发现并且开始研究的, 被认为是肿瘤坏死因子可诱导的初级应答基因, 其基因产物为锌指蛋白A20（zinc finger protein A20）[1, 2]。该蛋白具有抑制NFκB的活性和在一些细胞中具有抗凋亡作用的双重活性。研究发现A20在人宫颈癌HeLa细胞、 肺上皮A549细胞、 人肝癌HepG2细胞中不具有抗凋亡的功能, 目前还不清楚为什么仅有一些细胞受到A20的保护及其保护机制[3, 4]。目前对A20的研究主要集中于它在下调NFκB活性的机制及采用不同刺激因子刺激后A20表达水平的变化方面[5] 。对A20在前列腺癌各细胞系中的表达状况, 所起的作用及作用机制还不清楚[6]。本研究中我们采用RTPCR和Western blot对PC3、 PC3M、 LNcap、 Du145和22RV1人前列腺癌细胞中A20进行检测, 为下一步研究A20在前列腺癌形成及发展中的机制奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料 人前列腺癌细胞由本室保存, RPMI1640培养基为Gibco公司产品。小牛血清为杭州四季青公司产品。A20单克隆抗体（mAb）购自Calbiochem公司; 羊抗小鼠的二抗, ECM显色液及βactin mAb购自武汉博士德公司; Trizol试剂购自Invitrogen公司; cDNA反转录试剂盒购自Promega公司, 细胞裂解液为碧云天公司产品。电转印仪为BIORAD公司Mini2D cell电转印仪, DU800核酸蛋白分析仪为贝克曼公司产品。所有引物均由TaKaRa公司合成。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 PC3、 PC3M、 DU145、 LNCaP和22RV1细胞均用含100 mL/L小牛血清、 100 U/mL青霉素、 100 U/mL链霉素的RPMI1640在37℃, 50 mL/L CO2培养箱中常规传代培养。
1.2.2 RTPCR检测mRNA 提取总RNA, 然后加入20 μL DEPC处理的水溶解所提取的RNA, 将稀释后的RNA在DU800核酸蛋白分析仪上检测, 测得A260/280大于18, 说明所提取的RNA质量好。取2 μg RNA按照Promega的逆转录试剂盒说明书, 反转录出cDNA后, 进行PCR。PCR的反应条件为: 95℃ 5 min, 95℃ 40 s, 63℃ 1 min, 72℃ 15 min, 72℃ 7 min共30个循环。A20的引物如下: 正义链5′AGCCCTCATCGACAGAAACATCCAG3′, 反义链: 5′CGCTGTTTTCCTGCCATTTCTTGTA3′, 扩增片断长度882 bp。内参照选用βactin, 引物正义链: 5′GCTCGTCGTCGACAACGGCTC3′, 反义链: 5′CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC3′, 产物长度353 bp。扩增产物15 g/L琼脂糖凝胶电泳, EB染色后, 电泳条带经电泳图像分析扫描仪扫描, 得到βactin条带, 调整cDNA的用量使5个细胞系中βactin条带的浓度一致, 然后进行A20基因的扩增,电泳条带经电泳图像分析扫描仪扫描, 得到A20的条带。经图像分析软件分析, 得到各A20条带的灰度值,峰高及密度。
1.2.3 Western blot检测 待细胞在直径为10 cm 培养皿上生长超过90%底面积时, 加400 μL细胞裂解液提取细胞总蛋白并定量, 按4∶1加入上样缓冲液, 100℃煮沸5 min, 调整蛋白浓度至相同水平进行SDSPAGE电泳。电泳完毕后, 按操作说明将胶装入电转印仪, 80 V电转80 min后加5 g/L脱脂奶粉封闭; 加1∶250 PBS稀释的βactin、 1∶1000 PBS稀释的A20抗体4℃过夜; PBSTween洗涤, 加1∶5000稀释的二抗室温60 min; PBSTween洗涤后, ECM显影, 定影。
1.2.4 统计学分析 检测结果均以x±s表示。多样本均数的两两比较（LSD）采用方差分析（ANOVA）。已统计软件SPSS100进行分析, P<005为具有统计学意义。
2 结果
2.1 RTPCR结果 5种前列腺癌细胞均有A20 mRNA的表达, 片段大小为882 bp, 与预计结果一致。各样本βactin对照均在相应位置353 bp处出现明显的扩增条带, 表明提取各细胞中RNA的质量及RTPCR过程均较良好（图1）, PC3、 PC3M、 Du145与22RV1之间有显著统计学差异(P<001), LNcap与22RV1之间没有统计学差异 (P>005), 说明A20在不同的前列腺癌细胞系中表达水平有差别, 在PC3、 PC3M中表达相对较高 （表1）。
图1 5种前列腺癌细胞A20的RTPCR结果（略）
M: DL2000 marker ; 1: PC3; 2: PC3M; 3: DU145; 4: LNcap; 5: 22RV1.
表1 A20 RTPCR产物琼脂糖电泳图像扫描分析结果（略）
bP<0.01 vs 22RV1.
2.2 Western blot分析 在相对分子质量(Mr) 80000附近, PC3、 PC3M、 Du145、 LNcap与22RV1细胞均有阳性条带, 与预期结果一致。通过与内参βactin（Mr42000）比较显示, PC3, PC3M中表达相对较高, 22RV1中表达相对较低（图2）。
图2 5种前列腺癌细胞A20的蛋白质结果（略）
1: PC3; 2: PC3M; 3: DU145; 4: LNcap; 5: 22RV1.
3 讨论
A20最初被认为是一种TNF诱发凋亡的抑制因子[1, 2]。对很多细胞系而言, A20稳定的高表达能够抑制TNF诱导的细胞凋亡。目前研究证实IL1和CD40等分子均可引起A20的高表达[7], 然而并不是在所有的细胞中, A20均表现出抑制细胞凋亡, 保护细胞的功能。在人类乳腺癌MCF7细胞、 鼠成纤维细胞瘤WEHI164细胞、 鼠胚胎成纤维NIH3T3细胞、 胰岛β细胞、 人脐静脉内皮细胞中均表现抗调亡功能[3, 4]。除了是一种抗凋亡分子之外, A20还被认为是一种NFκB依赖性基因表达的强大抑制剂, 能够直接负反馈调节NFκB的表达[5]。在许多不同细胞中, A20过度表达都能够阻断由于TNF、 IL1、 LPS和过氧化氢引起的NFκB的活化[7], 从而抑制炎症相关基因的表达, 防止体内炎症反应的失控。本研究结果显示, A20在PC3和LNCaP中的表达与国外报道的一致, 而在 PC3M, Du145和22RV1中的表达国内外未见报道。A20蛋白和mRNA的表达水平经方差分析显示表达水平不全相同(P<001), 采用多样本均数间的两两比较（LSD）采用方差分析（ANOVA）, PC3、 PC3M、 DU145与22RV1之间结果有统计学差异(P<001), 而LNCaP与22RV1之间没有统计学差异(P>005), 说明A20蛋白和mRNA在不同的前列腺癌细胞中表达水平不同, PC3和PC3M细胞中的表达相对较高。A20能够直接负反馈调节NFκB的表达, 从而将炎症反应限制到一定程度; 它还在某些细胞系中表现出抑制细胞凋亡, 保护细胞的功能。对A20在前列腺癌中的研究将有可能为前列腺癌的提供新的靶点和思路。
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[1] Dixit VM, Green S, Sarma V, et al. Tumor necrosis factoralpha induction of novel gene products in human endothelial cells including a macrophagespecific chemotaxin[J]. J Biol Chem, 1990, 265(5): 2973-2978.
[2] Opipari AW Jr, Boguski MS, Dixit VM. The A20 cDNA induced by tumor necrosis factor alpha encodes a novel type of zinc finger protein[J]. J Biol Chem, 1990, 265(25): 14705-14708.
[3] Opipari AW Jr, Hu HM, Yabkowitz R, et al. The A20 zinc finger protein protects cells from tumor necrosis factor cytotoxicity[J]. J Biol Chem, 1992, 267(18): 12424-12427.
[4] Storz P, Doppler H, Ferran C, et al. Functional dichotomy of A20 in apoptotic and necrotic cell death[J]. J Bio Chem, 2005, 387(1): 47-55.
[5] Ferran C, Stroka DM, Badrichani AZ, et al. A20 inhibits NFkappaB activation in endothelial cells without sensitizing to tumor necrosis factormediated apoptosis[J]. Blood, 1998, 91(7): 2249-2258.
[6] Golovko O, Nazarova N, Tuohimaa P. A20 gene expression is regulated by TNF, Vitamin D and androgen in prostate cancer cells[J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 2005, 94(1-3): 197-202.
[7] Malewicz M, Zeller N, Yilmaz ZB, et al. NFκB controls the balance between Fas and tumor necrosis factor cell death pathways during T cell receptor induced apoptosis via the expression of its target gene A20[J]. J Biol Chem, 2003, 278(35): 32825-32833.
