不同剂量配比的实验性甲型肝炎戊型肝炎联合疫苗的免疫原性研究

【关键词】  甲型肝炎病毒;,,戊型肝炎病毒;,,联合疫苗;,,剂量配比;,,免疫原性

　　Immunogenicity of experimentally combined hepatitis A and hepatitis E vaccine at different dosage ratio

　　[Abstract]  AIM: To evaluate the immunogenicity of experimentally combined hepatitis A and hepatitis E (cHA+E) vaccine and analyze the interactions between the two antigenic components in vaccine. METHODS: Nine different dosage ratio of the cHA+E vaccine,  A500+E200, A500+E100, A500+E50, A250+E200, A250+E100, A250+E50, A125+E200, A125+E100 and A125+E50 (U+mg)/L,  was prepared from an inactivated hepatitis A (HA) vaccine and a hepatitis E (HE) vaccine. 120 mice were immunized with the cHA+E vaccine,  HA vaccine and HE vaccine alone in different doses,  respectively. Mice were bled before immunization and 2,  4,  6,  8,  10,  12 and 14 weeks post immunization. Specific antibodies against hepatitis A and E viruses were detected by ELISA and neutralization assay. RESULTS: After immunization with different dosages of cHA+E vaccine,  all animals developed hepatitis A virus antibody (antiHAV) and hepatitis E virus antibody (antiHEV). AntiHAV responses increased with the concentration of the HA vaccine component in the cHA+E vaccine. AntiHAV neutralizing antibody titers reached 1∶1 024 when mice were immunized with cHA+E vaccine prepared from higher dosage (500 U/mL) of the HA vaccine. The titers only reached 1∶512 when lower dosages (250 and 125 U/mL) of HA vaccine were applied. However,  different dosages (200,  100 and 50  mg/L) of the HE vaccine component in the cHA+E vaccine developed no effects on the production of antiHAV neutralizing antibody. In addition,  comparing with the single HE vaccine,  the cHA+E vaccine induced higher level of antiHEV response. The antiHEV level increased with the concentration of HA vaccine component in the cHA+E vaccine. However,  there was no obvious relationship between the antiHEV levels and the different dosages （200,  100 and 50 mg/L）of the HE vaccine component in the cHA+E vaccine. Immune sera elicited by the cHA+E vaccine neutralized HEV infectivity when detected by an in vitro RTnPCRbased HEV neutralization assay. CONCLUSION: In cHA+E vaccine,  the HA vaccine component can increase the immunogenicity of the HE vaccine component,  and the HE vaccine component plays no adverse effects on the immunogenicity of the HA vaccine component.

　　[Keywords]hepatitis A virus;  hepatitis E virus;  combined vaccine;  dosage ratio;  immunogenicity

　　[摘 要]  目的: 研究实验性甲型肝炎（甲肝）戊型肝炎（戊肝）联合疫苗的免疫原性,  探讨两种抗原组分间的相互作用。方法: 制备9种不同剂量配比的实验性甲戊肝联合疫苗,  与单价疫苗对照一起免疫15组（共120只）小鼠,  定时采血,  以ELISA和中和试验检测抗HAV和抗HEV的抗体。结果: 高剂量的HAV抗原（5×105 U/L）与不同剂量的HEV抗原（200、 100、 50 mg/L）配制的联合疫苗,  诱导的抗HAV中和抗体的滴度可达1∶1 024,  含25×104、 125×103 U/L HAV抗原的联合疫苗诱导的中和抗体滴度为1∶512,  不同剂量的HEV抗原对抗HAV中和抗体的产生均无明显影响。与单价戊肝疫苗相比较,  联合疫苗诱导的抗HEV抗体水平均有明显升高,  且随联合疫苗中HAV抗原的含量（5×105、 25×104、 125×103 U/L）的增加而升高,  HEV抗原的剂量在一定范围内（200、 100、 50 mg/L）与抗HEV抗体产生无明显关系。采用基于逆转录套式PCR的中和试验表明,  各联合疫苗组的免疫血清均可中和HEV。结论: 实验性甲、 戊肝联合疫苗内HAV抗原对HEV抗原的免疫原性具有增强作用,  而HEV抗原对HAV抗原的免疫原性无明显影响。

　　[关键词]甲型肝炎病毒;  戊型肝炎病毒;  联合疫苗;  剂量配比;  免疫原性

　　2004年,  卫生部统计报告显示,  我国戊肝的发病率有上升趋势,  甲肝的发病率基本维持在往年的水平。控制这两种疾病最有效的方法,  是进行疫苗预防接种。目前,  国内外甲肝疫苗已上市多年,  戊肝疫苗正在研制中。随着国民的快速,  人员流动的日益增加,  对疫苗的需求也将日益增加,  因此,  加快、 加强新疫苗的研制具有重要的现实意义。为了减少疫苗接种的次数,  降低预防接种的成本,  提高疫苗的覆盖率和免疫效果,  开发和应用联合疫苗已成为当今疫苗的发展方向[1]。目前研究证明,  已有多种联合疫苗都是安全、 高效的,  并得到广泛使用。然而,  迄今关于预防甲肝和戊肝的联合疫苗的研制国内外尚未见报道。本研究在以往我们关于HEV重组蛋白诱导中和抗体研究工作的基础上[2-4],  首次采用灭活的甲肝疫苗与实验性戊肝疫苗进行不同剂量配比,  制备了实验性甲戊肝联合疫苗,  并对其免疫原性、 抗原组分间的相互作用进行了初步探讨,  旨在为进一步开发甲戊肝联合疫苗奠定基础。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  灭活甲肝疫苗由北京科兴生物公司馈赠,  并配制成3种剂量（分别为125×103、 25×104、 5×105 U/L）;  实验性戊肝疫苗系用大肠杆菌表达的HEV重组蛋白经纯化、 氢氧化铝佐剂（1 g/L）吸附制成,  也配制成3种剂量(分别为50、 100、 200 mg/L)。清洁级BALB/c小鼠120只,  雌性,  6~8周龄,  18~22 g,  购自扬州大学比较医学中心。抗HAV总抗体检测试剂盒,  购自唐山怡安生物有限公司。抗HEV抗体阴性的正常人血清和抗HEV抗体阳性的患者血清,  由南京市传染病检验科提供。

　　1.2  方法

　　1.2.1  实验性甲戊肝联合疫苗的制备  将不同剂量的灭活甲肝疫苗和实验性戊肝疫苗进行配比混合,  制成9种不同的实验性甲戊肝联合疫苗。其中两种抗原（灭活HAV抗原 A和HEV抗原 E）的浓度分别为A500+E200、 A500+E100、 A500+E50、 A250+E200、 A250+E100、 A250+E50、 A125+E200、 A125+E100和A125+E50 (×103 U+mg)/L。

　　1.2.2  实验动物分组和免疫方案  将小鼠随机分为15组,  每组8只。其中6个对照组（命名为A125、 A250、 A500和E50、 E100、 E200）,  分别皮下多点接种3种剂量的单价灭活甲肝疫苗和3种剂量的单价实验性戊肝疫苗各100 μL/只。接种后4、 6周,  经腹腔注射相同的疫苗,  50 μL/只,  加强免疫2次。9个联合疫苗实验组（命名为A500+E200、 A500+E100、 A500+E50、 A250+E200、 A250+E100、 A250+E50、 A125+E200、 A125+E100和A125+E50）,  分别皮下多点接种9种不同剂量配比的实验性甲戊肝联合疫苗各100 μL/只。接种后4、 6周,  经腹腔注射相同的疫苗,  50 μL/只,  也加强免疫2次。免疫前和免疫后2、 4、 6、 8、 10、 12、 14周,  所有小鼠均经眼眶静脉取血,  分离血清后贮存于－20℃。按试剂盒的说明书操作,  采用竞争ELISA法检测血清中的抗HAV的总抗体。根据的报道[5],  采用ELISA法测定血清中抗HEV抗体。血清的稀释度为1∶100,  每份标本设两个复孔,  取平均值判定结果,  以1∶10的免疫前的血清作为阴性对照,  P/N比值≥2.1者为阳性。

　　1.2.3  甲肝抗体中和试验  根据文献[6],  将不同时间采集的每组8只小鼠的血清,  分别进行等量混合,  系列稀释。然后将不同稀释度的血清与一定量的能产生细胞病变的HAV HM175毒株混合,  于37℃孵育1 h。接种单层FRHK4细胞,  于37℃培养5 d,  观察细胞的病变,  以能够抑制细胞病变的血清最高稀释度作为免疫血清的滴度。

　　1.2.4  抗HEV抗体中和试验  根据参考文献[5],  采用基于RTnPCR的体外中和试验,  将免疫后第14周采集的各实验性甲戊肝联合疫苗组（每组8只小鼠）的血清,  分别进行等量混合,  按1∶10、 1∶20、 1∶40、 1∶80系列稀释,  将不同稀释度的血清与一定量的含HEV的粪便滤液混合,  于37℃孵育1 h。接种单层PLC/PRF/5细胞,  于37℃继续孵育2 h,  洗涤3次,  按常规方法抽提核酸,  采用RTnPCR检测HEV RNA。同时,  以1∶10免疫前的小鼠血清、 抗HEV抗体阴性的正常人血清作为阴性对照,  以抗HEV抗体阳性的患者血清作为阳性对照。结果判定:  以PCR检测呈阴性者为中和抗体阳性。

　　1.2.5  统计学分析  应用SPSS10.0统计分析软件进行数据处理和分析。以P<0.05为具有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  抗HAV总抗体的检测  竞争ELISA的结果显示,  9种不同配比的实验性甲戊肝联合疫苗接种小鼠后, A500+E200、 A500+E100、 A500+E50组小鼠,  于首次接种后4周抗HAV抗体全部转阳,  其余各联合疫苗组小鼠于免疫后6周均可检出抗HAV抗体。单价甲肝疫苗组中,  A500组小鼠同样于首次接种后4 周全部出现抗HAV抗体阳转,  A250、 A125组小鼠于免疫后6 周抗HAV抗体转阳。

　　2.2  抗HAV中和抗体的检测  单价灭活的甲肝疫苗A500组与联合疫苗A500+E200、 A500+E100、 A500+E50组小鼠,  抗HAV中和抗体产生早、 滴度高,  末次免疫后8周抗体的滴度仍可达1∶1 024（表1）;  而单价灭活的甲肝疫苗A250、 A125组与联合疫苗A250+E200、 A250+E100、 A250+E50、 A125+E200、 A125+E100、 A125+E50免疫组的小鼠,  抗HAV中和抗体的产生较晚,  抗体的滴度低于单价灭活的甲肝疫苗A500组与联合疫苗A500+E200、 A500+E100、 A500+E50组,  末次免疫后8 周抗HAV抗体的滴度为1∶512（表1）。以上表明,  实验性甲戊肝联合疫苗诱导的抗HAV抗体的水平,  随联合疫苗内HAV抗原剂量的增加而升高,  与单价灭活甲肝疫苗相比较无明显差异,  提示在实验性甲戊肝联合疫苗中,  高剂量的HAV抗原有利于抗HAV中和抗体的产生,  而HEV抗原对HAV抗原的免疫原性无明显影响。

　　2.3  抗HEV抗体的产生  ELISA检测表明,  9组不同剂量配比的实验性甲戊肝联合疫苗接种小鼠后,  A500+E200、 A500+E100、 A500+E50组小鼠的抗体产生早,  于首次接种4周后,  抗HEV抗体全部阳转,  而联合疫苗组A250+E200、 A250+E100、 A250+E50、 A125+E200、 A125+E100、 A125+E50以及单价实验性戊肝疫苗E200、 E100、 E50组抗体的产生较晚,  于首次接种6 周后,  才出现抗HEV抗体转阳。比较表2、 3、 4的结果,  发现E200、 E100和E50 3组小鼠产生的抗HEV抗体的水平在整个实验过程中均无明显区别,  而且相同剂量的灭活甲肝疫苗与不同剂量的实验性戊肝疫苗配比制备的实验性甲戊肝联合疫苗,  诱导小鼠产生的抗HEV抗体的水平在整个实验过程中也无明显区别。但是表2、 3、 4的结果也表明,  不同剂量配比的实验性甲戊肝联合疫苗诱导产生的抗HEV抗体的水平均高于单价实验性戊肝疫苗,  而且随着联合疫苗内灭活甲肝疫苗含量的增加,  产生抗HEV抗体的水平也升高。如表2所示,  A500+E200联合疫苗组小鼠产生的抗HEV抗体的水平高于A250+E200联合疫苗组（2、 14周, P<0.05;  4周, P<0.01）;  A250+E200联合疫苗组小鼠产生的抗HEV抗体的水平高于A125+E200联合疫苗组（10、 12周, P<0.05）;   A125+E200联合疫苗组小鼠产生的抗HEV抗体的水平高于单价实验性戊肝疫苗组E200（8、 10周,  P<0.05;  6、 12、 14周, P<0.01）。表3、 4的分析结果与表2相似。表明在9组实验性甲戊肝联合疫苗中,  联合疫苗组A500+E200、 A500+E100、 A500+E50小鼠产生的抗HEV抗体的水平,  均高于联合疫苗组A250+E200、 A250+E100、 A250+E50、 A125+E200、 A125+E100和A125+E50。由此可见,  在实验性甲戊肝联合疫苗中,  实验性戊肝疫苗的剂量在一定范围内与抗HEV抗体产生的水平无明显关系;  而HAV抗原则能增强HEV抗原的免疫原性,  且随着联合疫苗中HAV抗原含量的增加而增强。

　　表1  定量灭活甲肝疫苗与不同剂量的戊肝疫苗联合免疫后不同时间抗HAV中和抗体的产生（略）

　　Tab 1  Production of antiHAV neutralizing antibodies at different time after immunization with a given HAV in combination with different doses of HEV vaccine

　　2.4  抗HEV中和抗体的检测  将免疫后第14周采集的各实验性甲戊肝联合疫苗组的每组8只小鼠血清分别等量混合,  并按1∶10、 1∶20、 1∶40、 1∶80 系列稀释后,  采用基于RTnPCR的体外中和试验检测抗HEV中和抗体。结果发现,  1∶10、 1∶20、 1∶40的各实验性甲戊肝联合疫苗组的血清,  均可有效地中和HEV对细胞的感染。提示各种配比的实验性甲戊肝联合疫苗,  均可诱导小鼠产生特异性的抗HEV中和抗体（图1）。

　　表2  200 mg/L戊肝疫苗与不同剂量灭活甲肝疫苗联合免疫小鼠诱导的抗HEV抗体的水平（略）

　　Tab 2  Levels of antiHEV antibodies induced by 200 mg/L hepatitis E vaccine in combination with different doses of inactivated hepatitis A vaccine

　　aP<0.05, bP<0.01 vs E200 group at the same time; cP<0.05, dP<0.01 vs A250+E200 group at the same time; eP<0.05, fP<0.01 vs A125+E200 group at the same time.

　　表3  100 mg/L戊肝疫苗与不同剂量灭活甲肝疫苗联合免疫小鼠诱导的抗HEV抗体的水平（略）

　　Tab 3  Levels of antiHEV antibodies induced by 100 mg/L hepatitis E vaccine in combination with different doses of inactivated hepatitis A vaccine

　　aP<0.05, bP<0.01 vs E100 group at the same time; cP<0.05, dP<0.01 vs A250+E100 group at the same time;  eP<0.05, fP<0.01 vs A125+E100 group at the same time.

　　表4  50 mg/L戊肝疫苗与不同剂量灭活甲肝疫苗联合免疫小鼠诱导的抗HEV抗体的水平（略）

　　Tab 4  Levels of antiHEV antibodies induced by 50 mg/L hepatitis E vaccine in combination with different doses of inactivated hepatitis A vaccine

　　aP<0.05, bP<0.01 vs E50 group at the same time; cP<0.05, dP<0.01 vs A250+E50 group at the same time; eP<0.05, fP<0.01 vs A125+E50 group at the same time.

　　图1  9组实验性甲戊肝联合疫苗免疫后第14周血清的体外中和作用（略）

　　Fig 1  Neutraliztion test of serum at 14 weeks after immunization with experimentally combined vaccine of hepatitis A and hepatitis E in 9 groups

　　1:  DNA marker;  2:  Mouse sera (1∶10) before immunization;  3:  Normal human sera (1∶40);  4:  AntiHEV sera (1∶40) of HEVinfected patient;  5:  Mouse antisera (1∶40) in A500+E50 group;  6:  Mouse antisera (1∶40) in A500+E100 group;  7:  Mouse antisera (1∶40) in A500+E200 group;  8:  Mouse antisera (1∶40) in A250+E50 group;  9:  Mouse antisera (1∶40) in A250+E100 group;  10:  Mouse antisera (1∶40) in A250+E200 group;  11:  Mouse antisera (1∶40) in A125+E50 group;  12:  Mouse antisera (1∶40) in A125+E100 group;  13:  Mouse antisera (1∶40) in A125+E200 group;  14:  Mouse antisera (1∶80) in A500+E50 group.

　　3  讨论

　　为了探讨甲戊肝联合疫苗研发的可行性,  本研究采用灭活甲肝疫苗和实验性戊肝疫苗进行不同剂量配比、 混合制备实验性甲戊肝联合疫苗,  通过免疫小鼠观察了抗HAV抗体、 抗HEV抗体水平的变化,  并对实验性甲戊肝联合疫苗中两种疫苗组分间的相互影响进行了初步探讨。研究证实,  与单价灭活甲肝疫苗对照组相比,  不同配比的实验性甲戊肝联合疫苗诱导小鼠产生的抗HAV抗体的水平无明显区别,  抗体水平随联合疫苗内HAV抗原含量的增加而升高,  说明在该联合疫苗中,  HEV抗原对HAV抗原的免疫原性无明显影响,  符合联合疫苗研究的基本要求。与单价实验性戊肝疫苗相比较,  不同配比的实验性甲戊肝联合疫苗能诱导小鼠更快更强的产生抗HEV抗体的应答,  而且抗HEV抗体的水平随联合疫苗中灭活HAV抗原含量的增加而升高。在以往甲乙肝联合疫苗研究的相关报道中,  也有学者发现联合疫苗诱导的抗HBV抗体的水平高于单价乙肝疫苗对照组,  推测可能是因为HAV抗原与HBV抗原联合后,  HAV抗原可作为佐剂而增强机体对HBV抗原的免疫应答[7]。但在DTPHibHepB五价联合疫苗的研究中,  却发现联合疫苗诱导的抗HBV抗体的水平低于单价乙肝疫苗组[8]。结合本研究的结果,  我们认为,  联合疫苗中不同抗原组分之间的相互作用非常复杂,  可能与佐剂的使用、 疫苗的纯度以及免疫程序等密切相关,  有待更加系统深入地研究。另外,  以往有研究证实,  HEV ORF2 基因编码的Mr约为55000的重组蛋白在0.4～50 μg剂量范围内,  均能诱导动物产生特异性的HEV抗体,  且抗体水平无明显差异[4, 9]。本研究中,  重组蛋白同样为HEV ORF2基因的编码蛋白,  且5、 10、 20 μg 3个剂量的实验性戊肝疫苗的免疫效果相似。因此,  我们认为这些结果一方面说明,  HEV ORF2基因的编码蛋白具有良好的免疫原性,  另一方面也提示HEV重组抗原的免疫剂量、 免疫程序都值得进一步探讨。本研究中,  我们在国内外首次开展了甲戊肝联合疫苗研究的尝试,  证实实验性甲戊肝联合疫苗具有比单价疫苗更好的免疫原性,  并能诱导小鼠产生特异性的抗HAV、 抗HEV的中和抗体,  而且证明HAV抗原能够增加HEV抗原的免疫原性,  为甲戊肝联合疫苗的进一步开发提供了依据。

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