变性高效液相色谱进行HLA-DRB1配型的可行性研究

                作者：王静波　李丹　潘凯枫　陆道培

【摘要】  　　为了探讨通过变性高效液相色谱（DHPLC）进行HLA-DRB1配型的可行性， 选择经PCR-SSP证实的20例HLA-DRB1相合及2例HLA-DRB1不相合的病人及其同胞供者的标本为实验对象，全部标本通过PCR扩增HLA-DRB1第二外显子基因片段，PCR产物经梯度变性处理后通过DHPLC检测，在部分变性温度下，检测病人与供者的HLA-DRB1第二外显子DHPLC峰型是否相同，以判断供受者的HLA-DRB1基因型是否相同。结果表明： DHPLC与PCR-SSP进行DRB1配型比较分析, 经kappa检验，kappa值为0.776， P值＝0.00， 说明两种方法的配型结果无显著性差别。结论： 变性高效液相色谱方法用于HLA-DRB1配型方便,实用并解决了HLA新基因的不断出现与相应的位点的引物或探针设计和开发的相对滞后之间的矛盾。

【关键词】  DHPLC HLA-DRB1配型 PCR-SSP

　　Feasibility of HLA-DRB1 Matching by Using DHPLC

　　AbstractTo study feasibility of HLA-DRB1 matching by using  denatured high  performance liquid chromatography （DHPLC）， 20 pairs of DNA samples from donors and recipients of  hematopoietic cell transplantation (HCT) for DRB1 matching and 2 pairs of samples from donors and recipient of HCT for DRB1 mismatching were studied by DHPLC and PCR-SSP.  After being amplified and annealed slowly  to produce heteroduplex， PCR products for exon 2 of DRB1 were detected by DHPLC to find matched or mismatched peaks in chromatogram. The results showed that DHPLC and PCR-SSP   were  consistant with matched or mismatched  HLA-DRB1 typing. The results of DHPLC and PCR-SSP for matching were compared by using kappa test（kappa＝0.776 , P= 0.00）,which suggested DHPLC for HLA-DRB1 matching was in agreement with PCR-SSP.  In conclusion, DHPLC for HLA-DRB1 matching is economic and convenient, moreover, will not be affected by unknown genes in HLA-DRB1 locus.

　　Key words DHPLC; HLA-DRB1 matching;   PCR-SSP

　　变性高效液相色谱（DHPLC）是一种新型的检测基因的多态性的方法［1］。这种方法是根据含有异源双链的PCR产物中不匹配碱基的种类，数量及排列顺序以及位置的差异产生不同的的DHPLC峰型，从而推测目的基因的多态性。由于HLA-DRB1片段的高度多态性，每一个等位基因的多态碱基的种类，数量及位置均不相同，其DHPLC峰型也应该不同。通过DHPLC进行供受者样本的基因型的直接比对，如果供受者的HLA基因型相同，则其DHPLC峰型也应该相同。反之，则DHPLC峰型不相同，从而达到判断供受者HLA配型是否相合的目的。编码HLA-DRB1抗原多态性的基因主要在HLA-DRB1第二外显子［2］，因此我们的研究重点主要在HLA-DRB1的外显子2。

　　材料和方法

　　标本来源

　　22对病人及其同胞供者标本均来自北京大学人民血液病研究所。

　　DNA提取

　　取抗凝血5 ml， 525×g离心10分钟。吸出白细胞层，加入红细胞裂解液10 ml，室温放置20分钟， 365×g离心10分钟，弃上清，重复2次，然后加入白细胞裂解液3 ml，蛋白酶K（10 mg/ml）75 μl、10% SDS 200 μl、37℃过夜后加入6 mol/L氯化钠1
 ml震摇15秒，充分混合后置4℃冰箱20分钟， 2 220×g离心20分钟，将上清液移至另一试管，加入等体积无水乙醇，封口倒转试管数次至絮状物折出，将絮状物移至1 ml  EP管中，加入75%乙醇0.8 ml，16 210×g离心1分钟，重复2次，弃上清，室温干燥30分钟，加入300 μl  TE溶液，DNA溶解后进行定量。

　　PCR

　　PCR扩增HLA-RB1外显子2引物为5'GGAGGCCGCCTGTGTGACTG3', 5'CCCAGCTCACAGGGACTCAGG3'。扩增片段为353 bp,   25μl PCR体系包括：  50 ng基因组DNA,0.2 μmol/L引物,200 μmol/L dNTP，2 U pfu，2 mmol/L氯化镁。扩增条件为94℃ 4分钟, 94℃ 45秒，72℃ 1分钟20秒，35个循环，72℃延伸10分钟。

　　DRB1的DHPLC分型及比对

　　PCR产物经过95℃ 3分钟变性，然后每分钟降1℃，直至45℃，PCR产物不需纯化处理，可直接通过DHPLC在部分变性温度下进行检测。流动相为0.1 mol/L TEAA（pH 7.0）和25%乙腈（acetonitrile），按不同梯度进行混合，部分变性温度为65.5℃, 流速0.9 ml/min，PCR产物首先在柱温50℃下检测，观察其DHPLC峰型是否为一单峰。如果DHPLC峰型为一单峰说明PCR产物中无非特异性扩增产物。然后，根据外显子2的熔解曲线设定柱温（部分变性温度）为65.5℃。在此温度下，具有不同HLA-DRB1等位基因的PCR产物可产生不同的DHLPC峰型，每一种DHPLC峰型都会产生不同的保留时间，保留时间相同，则DHPLC峰型也相同。根据保留时间和DHPLC峰型是否相同判断HLA-DRB1配型是否相同，其结果通过UV260紫外检测，WAVE MAKER系统自动存盘。

　　PCR产物克隆测序
　
　　对DRB1为杂合子的样本进行T-A克隆测序，对纯合子样本可进行PCR产物直接测序。pGEM-T载体试剂盒购自美国Promega公司，DNA克隆测序由上海申友生物技术有限公司在ABI PRISMTM377型DNA测序仪上进行。

　　PCR-SSP

　　采用美国PEL-FREEZ公司试剂盒标准方法进行。简言之，将待测标本加入含有taq酶及缓冲液、dNTP的反应物中，96℃预变性1分钟，96℃ 25秒，70℃ 50秒，72℃ 45秒，共5个循环；96℃ 25秒，65℃ 50秒，72℃ 45秒，共21个循环；96℃ 25秒，55℃ 60秒，72℃ 120秒，共4个循环。

　　统计学分析

　　DHPLC与PCR-SSP进行HLA-DRB1配行结果比较，采用kappa检验。

　　结果

　　HLA-DRB1  PCR-SSP法配型结果

　　22例病人及其同胞供者的DNA经PCR-SSP方法检测HLA-DRB1基因型，结果发现20 例病人及其同胞供者HLA-DRB1基因型相同，另2例病人及其同胞供者HLA-DRB1基因型不同（图1，附表）。 Table . Comparison of DRB1 matching results  by using DHPLC and  PCR-SSP（略）

　　HLA-DRB1纯合及杂合样本DHPLC的检测结果

　　根据PCR-SSP方法检测的HLA-DRB1的配型结果，选择2例HLA-DRB1纯合样本及1例HLA-DRB1杂合样本，在DHPLC的DNA分离柱温度为50℃时，DRB1纯合样本（图2）及杂合样本（图3）均表现为单峰。当DNA分离柱温度逐渐升高时，DRB1纯合样本仍表现为单峰（图2），DRB1杂合样本 随着DNA分离柱温度的升高逐渐变成多个峰（图3）。等位基因不同的两个纯合样本在一定的分离柱温度下表现为单峰，但混合后出现杂合峰型（图4）。图2、3、4中，左侧数字代表DRB1的基因型及DNA分离柱温度，右侧数字代表每个样本的编号。

　　HLA-DRB1  DHPLC配型结果

　　在确定HLA-DRB1纯合样本及HLA-DRB1杂合样本在DNA分离柱温度为50℃时均表现为单峰以及HLA-DRB1杂合样本的DNA分离柱的最佳温度(部分变性温度)为65.5℃后，在部分变性温度为65.5℃时检测22对经PCR-SSP检测HLA-DRB1相合及2对经PCR-SSP检测 HLA-DRB1不相合的样本。实验结果表明，PCR-SSP与DHPLC两种方法比较分析，仅1对不相符，经kappa检验，kappa值为0.776,  95％的可信区间为0.357-1.000， P值为0.00。 Kappa检验是假设二组样本属于不同总体P=0.00，这说明二组样本在不同总体的概率为0，所以二次样本HLA配型结果无显著差别，属于同一总体（附表）。图5为DHPLC图谱，共包括6组分图，在每一组图中，第一个峰为病人的色谱峰，第二个峰为供者的色谱峰，第三个峰为供受者标本混合后产生的色谱峰，供受者峰型相同并且供受者标本混合后峰型无改变时被认为HLA－DRB1配型相同，反之则认为HLADRB1配型不同。在每组图中，左侧数字代表DRB1的基因型，右侧数字代表每个样本的编号。其中，前3组图为DHPLC方法和PCR-SSP方法配型均完全相合的标本，第4组图为PCR-SSP方法配型相合， DHPLC方法配型不相合的标本，第5组图和第6组图为DHPLC方法和PCR-SSP方法配型均不相合的标本。 1对标本经DNA测序验证其结果与DHPLC配型结果一致（图6-7）。

　　讨论

　　DHPLC是一种新型的检测基因多态性的方法［1］，其原理是通过PCR产物变性后逐渐降温以形成异源双链，即异源双链中只有部分碱基相匹配，再根据目的基因片段的熔解曲线设计其部分变性温度（部分变性温度是指DNA双链比例在50%至75%之间的温度）。在该温度下，由于异源双链中存在不匹配的碱基，与同源双链相比，更易解成单链，首先通过DNA分离柱并被检测器检测。因此，含有异源双链的PCR产物与只含有同源双链的PCR产物在DHPLC检测器上出现时间（保留时间）不同，从而会产生不同的DHPLC峰型。而且，不同的异源双链中，由于其不匹配碱基的种类，数量及排列顺序以及位置的差异，其在部分变性温度下形成不同比例的单链，因此在DHPLC检测器上出现不同的保留时间，从而会产生不同的DHPLC峰型。在每一个DHPLC峰型中，峰高由待测PCR产物的产量决定，峰宽由保留时间决定，判断两个DHPLC峰型是否相同主要根据每一个DHPLC峰型的保留时间。根据上述原理，由于HLA-DRB1片段外显子2中的高度多态性，每一个等位基因的多态碱基的种类，数量及位置均不相同，从而产生了不同的保留时间，因此DHPLC峰型也不同。由此可见，可根据不同的DHPLC峰型结合DNA测序结果判断该基因片段的基因型， 从而可建立HLA等位基因与DHPLC峰型的对应关系，通过DHPLC峰型判断该样本的基因型。此外，DHPLC还可直接进行供受者样本基因型的比对，如果供受者的HLA的基因型相同，则其DHPLC峰型也应该相同，从而达到HLA-配型的目的。根据上述原理，我们对22对经PCR-SSP技术证实的不同等位基因的HLA-DRB1第二外显子进行检测，首先，我们把经梯度变性处理的每份标本的PCR产物在DNA分离柱温为50℃时进行检测（图2，图3），如表现为单峰，则说明PCR产物无非特异性扩增。在确定每份PCR产物无非特异性扩增后，我们根据预测的溶解曲线逐渐升高DNA分离柱温以确定最佳的部分变性温度。 当DNA分离柱温度逐渐升高时， DRB1纯合样本仍表现为单峰（图2），但DRB1杂合样本随着DNA分离柱温的升高逐渐变成多个峰（图3）。根据熔解曲线，我们设定的部分变性温度为65.5℃，在此温度下，根据不同DHPLC峰型的保留时间判断其是否相同。我们的结果表明，通过DHPLC对22例经PCR-SSP技术证实的不同等位基因的HLA-DRB1第二外显子进行检测，其DHPLC峰型明显不同。此外，我们把20例经PCR-SSP方法证实的HLA-DRB1相合的病人及其供者之间的DHPLC峰型进行比对，19例DHPLC峰型完全相同，经kappa检验， P＝0.00，说明两种方法的配型结果无显著性差别。实验中我们发现一个问题，如果供受者均为纯合基因型，但其基因型不同，其通过DHPLC检测均为单峰，这种情况应怎样鉴别？对此我们想了一个办法，即把供受者的PCR产物混合后变性， 再逐渐复性，如果其基因型不同，则会形成异源双链，通过DHPLC检测则会产生与供受者不同的DHPLC峰型，如果混合后的DHPLC峰型与供受者相同，则供受者匹配，反之则不匹配（图4）。研究表明，DHPLC进行HLA DRB1配型是可行的，特别是供受者之间峰型的直接比对是其它方法无法取代的。PCR-SSP方法的原理是根据不同的HLA等位基因，通过与其相匹配的序列特异性引物进行PCR产物扩增，然后再根据不同的PCR产物在电泳时所处的位置不同判断HLA基因型。PCR-SSP分型在检测HLA DR中的准确率为98%，在HLA-DQ中的准确率为91%，而且成本高，需扩增大量的PCR反应，常需要通过二步法即先低分辨，然后再高分辨方可解决上述问题［3］。此外，由于HLA新基因的不断出现，而相应的位点的引物设计和开发的相对滞后也影响了PCR-SSP的准确性［4,5］。DHPLC进行HLA配型的方法可在HLA-DRB1保守内含子区设计引物，DHPLC可通过供受者之间的峰型对比判断其配型是否相合，在一定程度上解决了引物设计与HLA新基因不断出现之间的矛盾，同时，由于DHPLC操作简便，同一PCR片段可检测多个多态位点，因此，无须扩增大量的PCR反应，其工作量明显小于PCR-SSP方法，并可节约大量成本，降低病人花费。因此，DHPLC应该被认为是一种很有前途的HLA配型的方法。

【】
  　　1 Arnold N, Gross E, Schwarz-Boeger U, et al. A highly sensitive, fast, and economical technique for mutation analysis in hereditary breast and ovarian cancers. Hum Mutat, 1999; 14: 333-339

　　2 郑德先主编. 血液学研究方法与技术. 北京：北京医科大学协和医科大学联合出版社，1999：386-387

　　3 Savelkoul PH, de-Bruyn-Geraets DP, van-den-Berg-Loonen EM. High resolution HLA-DRB1 SSP typing for cadaveric donor transplantation. Tissue Antigens,1995; 45:41-48

　　4 Bunce M, O'Neill CM, Barnardo MC, et al. Phototyping: comprehensive DNA typing for HLA-A,B,C, DRB1,DRB3,DRB4,DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCR-SSP). Tissue Antigens,1995;46:355-367

　　5 Schreuder GM, Hurley, CK, Marsh SG, et al. The HLA dictionary 2001: a summary of HLA-A,-B,-C,-DRB1/3/4/5, -DQB1 alleles and their association with serologically defined LA-A,-B,-C,-DR and -DQ antigens. Tissue Antigens, 2001; 58:109-140