新型人转录因子hBKLF对K562细胞增殖、分化及血红蛋白合成作用的研究
作者：王茫桔 马晓芸 石永进 武淑兰 贺福初
【摘要】 孕22周的胎肝是胎儿的主要造血器官，其中含有大量与造血相关的调控因子。人碱性Krüppel样因子(human basic Krüppel- like factor,hBKLF)是本研究室从这一时期胎肝cDNA文库中新克隆的转录因子。对其C端的结构分析发现，它含有3个特征性C2H2锌指结构，因此属于KLF转录因子家族。前期的表达谱研究工作显示，hBKLF在成人外周血白细胞、骨髓和胎肝中表达量高，在红系中有表达，这提示它可能与造血相关。本研究以K562细胞为模型，研究hBKLF与造血细胞增殖、分化及血红蛋白合成的关系。构建hBKLF正义及反义真核表达载体，转染K562细胞，经G418筛选4周，得到稳定细胞株；用RT- PCR、Western blot方法测定转染后K562细胞hBKLF表达水平的变化；以转染空质粒的K562细胞为对照组，在显微镜下直接观察转染正义质粒和反义质粒的两组细胞形态的改变；用MTT法比较增殖速率的变化；用甲基纤维素半固体培养法比较集落形成率的差别；用苯息丁法观察氯高铁血红素（hemin）诱导K562细胞分化后血红蛋白合成水平的差异。结果表明：正义质粒和反义质粒经NcoI酶切鉴定构建正确。转染正义质粒的K562细胞（正义组）中hBKLF的mRNA及蛋白质表达水平增加，转染反义质粒的K562细胞（反义组）中hBKLF的mRNA水平降低。增殖活性在反义组、正义组、对照组分别为1.335±0.022、1.067±0.010、1.118±0.014，反义组K562细胞的增殖速率加快，正义组细胞增殖速率减慢（P<0.001）。细胞形态在各组间无明显区别。集落形成率在反义组、正义组、对照组分别为148±13、136±10、141±10，各组间无显著差异（P>0.05）。3组细胞血红蛋白合成水平在hemin诱导后均升高，诱导后血红蛋白升高倍数在对照组、反义组、正义组分别为9.064±1.637、14.360±2.185、4.820±0.404，反义组K562细胞合成血红蛋白能力增加，正义组合成血红蛋白能力下降（P<0.05）。结论：hBKLF可以抑制K562细胞的增殖，对血红蛋白合成有负调控作用，但未观察到hBKLF对细胞形态及克隆形成率的影响。
【关键词】 hBKLF 血红蛋白; K562; 细胞增殖; 细胞分化
Effect of the New Human Transcription Factor hBKLF on the Prolifera-tion, Differentiation of K562 Cell Line and Hemoglobin Synthesis
Department of Hematology, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China; 1Department of Genomics and Proteomics, Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Chinese National Human Genome Center at Beijing, Beijing 100850, China
Abstract The human basic Krüppel-like factor （hBKLF） is a newly cloned human transcription factor from the cDNA library of fetal liver. It belongs to the Krüppel- like transcription factor family. Previous expression study showed that it is a hematopoietic related factor. This study was aimed to investigate the effect of hBKLF on cell proliferation, differentiation and hemoglobin synthesis by using K562 cell line as model. The sense and antisense expression plasmids of hBKLF were constructed, and transfected into K562 cells by lipofectamine. After G418 selection for 4 weeks, the cell line with stable expression of the gene was obtained. Then the hBKLF expression level, proliferation ability, colony formation and hemoglobin production were detected by RT-PCR and Western blot, MTT method, methyl cellulose semisolid culture method and benzidine test respectively. The morphologic change of cell was observed with inverted microscope. The results showed that the sense plasmid could increase hBKLF level and antisense plasmid could decrease hBKLF expression. When hBKLF level was down-regulated, K562 cells could proliferate more quickly and synthesize more hemoglobin. But there were no differences in colony formation ability and no apparent morphologic change.It is concluded that hBKLF can inhibit hematopoietic cell proliferation and hemoglobin synthesis. It is suggested that hBKLF
plays an important role in the proliferation and differentiation of hematopoietic cells.
Key wordshBKLF; hemoglobin; K562; cell proliferation; cell differentiation
人碱性Krüppel样因子（human basic Krüppel- like factor， hBKLF)是我室近年从人胎肝cDNA文库中克隆的新型转录因子［1］，其N端含3个连续的C2H2锌指结构，这是KLF转录因子家族的共同特征［2］，因此hBKLF是KLF家族的新成员。这一家族的成员还有EKLF［3］、GKLF［4］、LKLF［5］，IKLF［6］等。已知EKLF特异地调控β珠蛋白的表达；GKLF、IKLF与细胞的增殖、分化有关；LKLF与T细胞的活化、记忆有关,但hBKLF的功能尚不清楚。我室前期对hBKLF在人类胎儿组织、成人组织、造血细胞中的表达谱研究提示，hBKLF可能与造血相关。本研究试图以K562细胞为模型，研究hBKLF与造血细胞增殖、分化及血红蛋白合成的关系。
材料和方法
细胞系、菌株、质粒及试剂
人胎肝cDNA文库、K562细胞、COS-7细胞、JM109大肠杆菌、pcDNA3.1/myc-his C质粒为我室保存。Wizard PCR产物回收试剂盒、Wizard质粒纯化试剂盒、AMV高效逆转录试剂盒均购自Promega公司。小牛血清、胎牛血清购自Hyclone公司。RPMI 1640购自Gibco公司。G418、MTT、Hemin购自Sigma公司。Lipofectamine购自Life technologies公司。2.7%甲基纤维素由北大血液科提供，1%苯息丁由军事医学院九所提供。
质粒构建
hBKLF正义引物P1：5′-CAGAAGCTTACTAAA AGAATGCTCATGT-3′ ，P2：5′-ACTCTCGACTGA CTAGCATGTGGCG-3′。反义引物：P3： 5′-CAACT CGAGAACACCAGAGCACCCTAGAA-3′，P4：5′-ACGAAGCTTCCGATAAGGAGACCGTGAGA-3′。 以人胎肝cDNA为模板，PCR扩增hBKLF。PCR循环参数：94℃预变性5分钟；94℃ 1分钟；58℃ 1分钟；72℃ 1分30秒，共35个循环；72℃延伸7分钟。产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，用Wizard PCR产物回收试剂盒回收，用HindIII/XhoI酶切后连入经CIAP去磷酸化处理的pcDNA3.1/myc-his C质粒HindⅢ/XhoⅠ位点中。连接产物转化JM109大肠杆菌，随机挑取5-7个克隆，酶切鉴定。鉴定正确的克隆进一步测序鉴定。
细胞培养、转染及稳定株的筛选
K562细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640于37℃、 5% CO2细胞培养箱中培养。转染时，将2×106/ml对数期细胞接种于6孔板中，每孔接种0.8 ml；加入3-4 μg质粒与20 μl lipofectamine的混合物，7-8小时后补充4 ml新鲜培养液，24-48小时左右按1∶5-10分瓶，72小时后加入G418（终浓度800 μg/ml）筛选，每3天换液1次，筛选4周，获得稳定细胞株。用有限稀释法将多克隆细胞以1个细胞/孔接种于96孔板进行单克隆化。COS- 7细胞用含10%小牛血清的DMEM（高糖）于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。转染时，将2×105/孔对数期细胞接种于6孔板中，培养过夜，至70%-80%融合，每孔加入2 μg质粒与10 μl Lipofectamine的混合物，继续培养7-9小时后换液，转染后24-48小时收获细胞。
蛋白表达的Western blot测定
细胞用冰预冷的1×PBS洗2遍，按每孔500 μl加入冰预冷的RIPA(1×PBS，0.1% SDS, 0.5%脱氧胆酸钠，1% NP- 40)，冰上慢摇20分钟后，将细胞刮下，4℃，12 000×g离心10分钟，保留上清。蛋白样品经SDS- PAGE凝胶电泳分离后转膜，电流按（2×cm2膜面积）mA，转膜2-3小时，于TBSTM(5%脱脂奶，0.05%吐温20)中4℃封闭过夜，用TBST(0.05%吐温20)漂洗10分钟，共3次，加辣根过氧化物酶标的抗myc抗体（1∶2 000-1∶5 000），室温慢摇1小时，TBST漂洗3次后，TBS漂洗1次，ECL显色5分钟，压片2分钟。
mRNA表达的RT- PCR检测
常规方法提取细胞RNA，按AMV高效逆转录试剂盒说明书，取1 μg总RNA逆转录为cDNA，RT- PCR比较hBKLF表达量的改变，循环参数同前。设GAPDH为参照，引物为P5：5′-ACCACCATGGA GAAGGCTGG-3′，P6：5′-CTCAGTGTAGCCCAGG ATGC- 3′。
MTT试验
取对数期细胞，以3×104/ml重悬，按每孔200 μl接种于96孔板中，培养48小时后每孔加入MTT（5 mg/ml）15 μl，继续培养4-6小时后每孔加入100 μl含0.01 N HCl的10％ SDS，室温振荡溶解8小时，用酶标仪于570 nm处测定吸光值。每个实验组重复5孔，求平均值作为各组的MTT值。
集落形成率
取对数期细胞，以1×104/ml重悬，按每孔100 μl接种于6孔板中，同时加入1 ml RPMI 1640，1 ml胎牛血清，1 ml 2.7％甲基纤维素。充分混合，培养7天后于倒置显微镜下计数集落数。每个实验组重复3孔。
细胞形态学观察
取细胞直接于倒置相差显微镜下观察。
血红蛋白测定
细胞悬液用1×PBS洗2遍后用去离子水重悬，反复冻融3次，室温15 000×g离心45分钟，取100 μl上清采用苯息丁法测定血红蛋白含量。每个实验组重复3孔。苯息丁法测定游离血红蛋白：设立空白管、标准管、测定管，按顺序于小杯中加入1％苯息丁0.5 ml、样品0.1 ml、1％ H2O2 0.5 ml，室温下静置20分钟，然后加入10％醋酸5 ml，静置10分钟后测定520 nm处吸光值。按公式样品血红蛋白含量。样品中血红蛋白浓度＝（测定管OD520 / 标准管OD520）×标准管血红蛋白浓度×稀释倍数。
统计学处理
MTT值、克隆形成率、血红蛋白升高倍数以平均值±标准差(X±SD)表示，各组细胞间的均值采用方差分析，均数间的多重比较采用Dunnett-t检验。
结果
hBKLF正义及反义表达载体的构建
选择pcDNA3.1/myc-his C质粒作为真核表达载体，使插入的基因以带有myc-his标签的融合蛋白形式表达出来，便于用myc抗体检测表达产物。为了构建正义质粒，根据hBKLF cDNA序列设计正义引物，扩增其完整ORF序列，正义引物使读码框与myc/his标签蛋白一致，正义下游引物不加终止密码子，利用载体上终止密码子，预期获得1063 bp片段。反义引物扩增跨越起始密码子ATG的N端564 bp片段。引物的两端带有HindⅢ/XhoⅠ酶切位点，但将其酶切位点进行对调，以便反向插入载体中。以上两对引物的PCR扩增产物连入pcDNA3.1/myc-his C载体的HindⅢ/XhoⅠ多克隆位点，获得的正义及反义重组质粒经酶切及测序鉴定正确（图1A，1B）。
为了鉴定hBKLF正义质粒是否能正确表达hBKLF/myc-his融合蛋白（41 kD），将其转入COS-7细胞，提取COS-7细胞在pcDNA3.1/ myc-his-hBKLF质粒转染前后的总蛋白，采用Western blot方法用myc抗体检测。结果显示，转染前细胞中无hBKLF/myc-his融合蛋白，转染后细胞中出现预期的41 kD条带。这表明hBKLF的正义质粒可以表达完整的hBKLF蛋白（图2）。
达hBKLF正义及反义基因的K562细胞株的建立
为了观察hBKLF对K562细胞增殖、分化、血红蛋白合成的影响，分别用空质粒、hBKLF正义质粒、hBKLF反义质粒转染K562细胞，于800 μg/ml G418中筛选4周，出现了稳定转染的K562细胞，单克隆化后分别提取各组细胞的总RNA，用RT-PCR方法检测hBKLF表达水平。为了提高比较的灵敏度，分别在PCR的22、26、30个循环时取扩增产物，比较各组在不同循环数时hBKLF的水平，结果如图3。由图3可以看到，正义细胞株中hBKLF表达量增加，反义细胞株中hBKLF表达量下降。这一结果表明正反义质粒已经稳定整合入K562基因组中，且可以正常工作。
hBKLF对K562细胞增殖速率、集落形成率及细胞形态的影响
为了了解hBKLF对细胞增殖速率的影响，以同一密度将以上三组细胞株接种于96孔板中，采用MTT方法观察hBKLF对细胞增殖活力的影响，结果绘制成图4。从图4中可以看到，增殖活性在反义组、正义组、对照组分别为1.335±0.022，1.067±0.010，1.118±0.014。正义组增殖速率慢于对照组，而反义组增殖速率较对照组高（P<0.001），提示hBKLF可抑制造血细胞增殖。3组细胞在形态学上未观察到明显差异。反义组、正义组、对照组细胞的集落形成率分别为148±13，136±10，141±10，无显著差异（P＝0.429）（图5）。
hBKLF对K562细胞血红蛋白合成的影响
K562细胞可以合成血红蛋白，合成量在hemin诱导下可增加。为了研究hBKLF表达水平对这一过程的影响，我们在Hemin诱导前后采用苯息丁法测定各组细胞血红蛋白的含量，结果显示，诱导前各组细胞血红蛋白表达水平均很低，且表达量相似，hemin诱导后各组细胞血红蛋白表达量较诱导前均有增加，增加倍数在对照组、反义组、正义组分别为9.064±1.637，14.360±2.185，4.820±0.404(图6)。这提示hemin诱导后各组细胞血红蛋白合成能力不同，反义组细胞合成血红蛋白量较对照组增加，正义组较对照组下降（P<0.05）。因此，hBKLF对K562的基础血红蛋白表达量影响不大，但可能抑制hemin诱导的血红蛋白的表达。
讨论
Krüppel转录因子家族是锌指蛋白超家族的一个亚家族，它们的共同特征是在蛋白的C端含3个连续的C2H2锌指结构，由于这种锌指结构与果蝇分节蛋白Krüppel类似，因而得名Krüppel- like factor［2］。这一家族中首先被发现的是EKLF［3］，EKLF 敲除小鼠在胎肝定向造血开始建立时表现出严重贫血，胎肝苍白，最终死于宫内。进一步研究发现，贫血是由于β珠蛋白合成减少导致的，说明EKLF对于β珠蛋白合成至关重要。其他能够调控珠蛋白合成的KLF分子还有FKLF［11］、FKLF2［12］。我室从人胎肝cDNA文库中克隆的hBKLF,其C端含有典型的类Krüppel锌指结构，因此它是KLF家族的新成员。hBKLF是否同样参与珠蛋白转录的调控呢？从我室前期对hBKLF表达谱研究发现［1］，它确实在红细胞中有表达，并且表达量随着红细胞的成熟而增加。这进一步提示hBKLF可能与珠蛋白表达有关。由于K562细胞表达hBKLF［1］,同时可以表达ε、γ珠蛋白，具有向红系分化的特征，因此K562细胞是研究hBKLF功能的理想模型［7-10］。本研究试图通过正义质粒及反义质粒稳定转染K562细胞来提高或降低K562细胞内hBKLF水平，比较它们对K562细胞血红蛋白合成的影响，同时观察hBKLF对细胞形态、增殖速率、克隆形成率的作用。结果发现，反义质粒可以显著提高hemin诱导的K562细胞血红蛋白的表达量，提示hBKLF在体内可能抑制血红蛋白的表达，是一种转录抑制因子，而以往发现的EKLF、FKLF［11］、FKLF2［12］等都是激活血红蛋白表达的，这一结果为血红蛋白复杂的调控机理增加了新的解释，对于hBKLF在众多调控血红蛋白的分子中的角色提出了新的问题。对于以上结果另外可能的解释是，血红蛋白不是hBKLF的靶基因，其表达量的改变不是hBKLF的直接作用，而是由于其信号调控通路中的其他分子受到了hBKLF的影响，这些分子才是hBKLF真正的靶基因。结果还表明，反义质粒可以明显提高K562的增殖速率，提示hBKLF能够抑制细胞增殖。这可能是通过抑制细胞分裂或促进细胞凋亡实现的，因此，hBKLF的靶基因中可能存在抑制细胞增殖或促进细胞凋亡的分子。因此，寻找hBKLF的靶基因对于阐明它的功能是十分重要的，目前对于转录因子的研究发现，转录因子的特异性不仅取决于DNA结合区的结合特性，还取决于转录功能区介导的不同的蛋白质间的相互作用。hBKLF的DNA结合区高度保守的结合特征使凡是具有CACCC盒的基因都有可能成为它的靶基因，那么其N端转录活性区就是至关重要的。搞清与hBKLF N端相互作用的蛋白质成分，将有助于解释它的功能。
【】
1 王茫桔,瞿祥虎,王立升等. 人类新型Krüppel类转录因子hBKLF的cDNA 克隆、亚细胞定位及表达特征. 遗传学报, 2003; 30:1-9
2 Schuh R, Aicher W, Gaul U, et al. A conserved family of nuclear proteins containing structural elements of the finger protein encoded by Krüppel, a Drosophila segmentation gene. Cell,1986; 47: 1025-1032
3 Anderson KP, Kern CB, Crable SC, et al. Isolation of a gene encoding a functional zinc finger protein homologous to erythroid Kruppel- like factor: identification of a new multigene family. Mol Cell Biol, 1995; 15: 5957-5965
4 Shields JM, Christy RJ, Yang VW. Identification and characterization of a gene encoding a gut- enriched Krüppel- like factor expressed during growth arrest. J Biol Chem, 1996; 271: 20009-20017
5 Wani MA, Conkright MD, Jeffries S, et al. cDNA isolation, genomic structure, regulation, and chromosomal localization of human lung Kruppel- like factor. Genomics, 1999; 60:78-86
6 Shi H, Zhang Z, Wang X, et al. Isolation and characterization of a gene encoding human Kruppel- like factor 5 (IKLF): binding to the CAAT/GT box of the mouse lactoferrin gene promoter. Nucleic Acids Res, 1999; 27: 4807-4815
7 Andersson LC, Jokinen M, Gahmberg CG. Induction of erythroid differentiation in the human leukaemia cell line K562. Nature, 1979; 278(5702): 364-365
8 秦建平. K562细胞的诱导分化与表型.重庆医科大学学报, 1997; 22: 166-170
9 张祖洵，李爱华，曾小澜等. K562细胞模拟骨髓造血多能干细胞的实验应用. 生化药物杂志, 2000; 21:52-53
10张彦. 人类红白血病细胞株K562的诱导分化机制. 国外医学·临床生物化学与检验学分册, 1996，17: 229-231
11 Asano H, Li XS, Stamatoyannopoulos G. FKLF, a novel Kruppel- like factor that activates human embryonic and fetal beta- like globin genes. Mol Cell Biol, 1999; 19:3571-3579
12 Asano H, Li XS, Stamatoyannopoulos G. FKLF- 2: a novel Kruppel- like transcriptional factor that activates globin and other erythroid lineage genes. Blood, 2000; 95:3578-3584
