酪氨酸激酶抑制剂对转染p15基因的K562细胞的作用
【摘要】 本研究探讨酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼（imatinib）和p15基因克隆联合作用对K562细胞的增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。 用RT?PCR扩增p15基因，胶纯化回收后连接到T载体测序，确认序列正确后构建p15?pcDNA3.1载体，将p15?pcDNA3.1与空载体分别以脂质体转染入p15基因突变的K562细胞，经筛选得到G418抗性的K562细胞株；用Western blot检测转染后P15蛋白的表达；用MTT法测定细胞存活率；流式细胞术检测细胞周期和凋亡。结果表明：从对照K562细胞中扩增的DNA片段，在第174-180位点有7个碱基缺失，这证实对照K562细胞中p15基因部位基因缺失。表达外源性P15蛋白的p15?pcDNA3.1?K562细胞株生长速度明显慢于对照K562细胞株；流式细胞术显示G0/G1期细胞增多，S期细胞明显减少；p15?pcDNA3.1?K562细胞与伊马替尼联合应用后凋亡细胞比例明显上升，MTT法显示细胞存活率较对照细胞明显下降。 结论： 表达外源P15蛋白联合应用伊马替尼对抑制K562细胞增殖及促凋亡方面具有协同作用。
【关键词】 p15基因 氨酸激酶抑制剂 伊马替尼 K562细胞
Effect of Tyrosine?kinase Inhibitor on p15 Gene Transfected K562 Cells
Abstract The objective of study was to investigate the combined effect of tyrosine?kinase inhibitor（imatinib） and p15 gene on the proliferation, cell cycle and apoptosis of chronic myeloid leukemia cell line K562. p15 gene was amplified from peripheral blood mononuclear cells by RT?PCR, and confirmed by DNA sequencing, then the recombinant p15?pcDNA3.1 vector was constructed and transfected into K562 cell line by Lipofectine. After screening with G418, p15?pcDNA3.1?K562 cell clone stably expressing P15 was isolated. P15 protein was identified by Western blot. The cell survival rate was determined by MTT, cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry. The results showed that partial deletion of p15 gene in K562 cells was verified by DNA sequencing, leading to the function of P15 protein to be lost. The expression of P15 protein can be detected by Western blot in p15?pcDNa3.1?K562 cells. A strong inhibition of cell proliferation was observed in p15?pcDNA3.1?K562 cells as compared with that of the control K562 cell. The cells of G0/G1 phase in p15?pcDNA3.1?K562 cells increased apparently, and S phase cells declined signifcantly. Cell cycle was arrested in G0/G1 phase. The percentage of apoptotic cells greatly increased after transfection with p15?pcDNA3.1?K562 cells combined with imatinib, and cell survival rate notably declined. It is concluded that the imatinib in combination with the expression of p15 gene has a synergistic effect on the inhibition of K562 cell proliferation and promotion of its apoptosis.
Key words p15 gene; tyrosine?kinase inhibitor; imatinib; K562 cell
p15基因是细胞周期蛋白激酶抑制剂家族中重要的一员,被认为具有抑癌基因样作用［1］，其在多种白血病中存在突变及甲基化失活［2］是导致白血病发病的重要原因之一。它与慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）急性变的关系是目前研究的热点。一种酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼（imatinib）对P210 BCR?ABL蛋白激酶具有高度特异的抑制作用［3］，对CML具有良好的效果，但它有着耐药、停药后复发以及对急变期细胞疗效差等诸多问题［4，5］，联合治疗是CML急变期研究的一个方向。将p15基因克隆与伊马替尼联合应用于CML有可能发挥更理想的治疗作用。
药物
伊马替尼（瑞典Novartis公司赠送，商品名格列卫），用三蒸水配制成1.00 mmol/L溶液，过滤除菌。
实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(1)酪氨酸激酶抑制剂对转染p15基因的K562细胞的作用
细胞培养
K562细胞（属于慢性粒细胞白血病急性变成红白血病的细胞株，含bcr?abl融合基因，表达P210蛋白）按常规方法在含100 ml/L的小牛血清的RPMI 1640培养液中，于5% CO2孵箱中培养。
菌种和质粒
pcDNA 3.1真核克隆表达质粒购自美国Invitrogen公司，E.coli JM109菌种由第四军医大学生化教研室提供。
试剂
限制性内切酶EcoRI和HindⅢ、TaqDNA聚合酶、T4连接酶、逆转录酶等工具酶分别购自宝泰克、上海生工生物工程公司，TRIzoL RNA提取试剂、DNA纯化试剂购自Invitrogen公司，p15鼠抗人单克隆抗体、羊抗鼠二抗购自Santa cruz公司，G418购自华舜公司。
引物设计与合成
P15 上游引物：5′ ?GTAAGCTTATGGCCACGTCTC TGGATTTTA?3′；下游引物：5′ ?TGGAATTCTTAA CT ACTAGACCAATCTTGA?3′，上下游分别加入HindⅢ 和EcoRI酶切位点，引物由上海生工生物工程公司合成。
RT?PCR
用TRIzoL从外周血单个核细胞提取总RNA，反转录成cDNA后进行PCR，由cDNA 0.2 μg、10 mmol/L的dNTP0.5 μl、引物10 pmol、Taq DNA聚合酶1U组成的反应体系25 μl，94℃ 45秒、55℃ 40秒、72℃ 1分钟，30个循环，最后延伸30分钟，产物经1%琼脂糖电泳，EB染色后在紫外反射投射仪扫描成像。
PCR产物胶回收
将PCR产物电泳条带切下，用胶回收液试剂盒回收PCR产物，乙醇沉淀。
T载体连接及DNA序列测定
取胶回收产物5 μl，加T载体1 μl、快速连接液4 μl，16℃孵育4小时后转染入JM109菌株，蓝白筛选后挑取白色克隆摇菌，酶切鉴定后将阳性克隆送上海生工生物工程公司测序。
p15?pcDNA3.1重组质粒的构建和转染
用HindⅢ 和EcoRI内切酶分别将pcDNA3.1和连接上p15的T载体酶切,在T4连接酶作用下进行重组连接,转染到JM109菌株中,酶切鉴定的阳性克隆提取质粒,用脂质体转染至K562细胞。48小时后细胞培养在含500 mg/L的G418的RPMI 1640培养液中进行稳定转染筛选阳性克隆，28天后将筛选阳性克隆存种。
P15蛋白、cyclin D1蛋白表达的Western blot检测
收集K562细胞，用数倍于细胞体积的细胞裂解液（成分包括：20 mmol/L 羟乙基派嗪乙磺酸、 pH 7.9, 150 mmol/L 氯化钠、 1 mmol/L 氯化镁、 5 mmol/L乙二胺四乙酸二钠盐、 pH 8、 0.1%诺乃洗涤剂P?40、 0.5% 脱氧胆酸盐钠、 0.1% 十二烷基硫酸钠、 50 mmol/L 氟化钠、 5 mmol/L原矾酸盐钠）制备Western blot提取物，冰浴20分钟。将20 μg裂解产物进行变性聚丙烯酰胺电泳，电转至硝酸纤维素膜后，加入特异性P15、cyclin D1鼠抗人单克隆抗体，以过氧化酶标记的羊抗鼠二抗识别一抗，以化学增强发光法显像。
细胞生长指数及细胞存活率MTT法检测
将5×104/ml细胞分别接种于96孔板，实验分3组：p15作用组、伊马替尼作用组、联合作用组。预实验中伊马替尼设6种不同浓度浓度，分别为0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μmol/L，发现0.5 μmol/L浓度即具有明显抑制k562细胞生长作用，故实验中伊马替尼作用组取0.5 μmol/L浓度。每组设3孔，取平均值，培养1、2、3、4、5天后，分别计数细胞，绘制细胞生长曲线及细胞存活率，实验重复3次。
细胞周期及凋亡的流式细胞术测定
脂质体转染p15?pcDNA3.1载体至K562细胞，与伊马替尼共同作用48小时后，收集细胞，用PBS洗2次，以700 ml/L的预冷乙醇固定2小时以上，经磷酸钠?柠檬酸钠缓冲液抽提处理，RNase A消化，碘化丙锭染色30分钟后，应用流式细胞仪进行测定。
统计学处理
用SPSS 11.0统计软件进行数据分析，组间比较采用重复测量数据方差分析，两两比较采用Dunnett t 检验。结 果
p15基因的RT?PCR扩增
通过RT?PCR方法从外周血单个核细胞扩增p15基因的全长cDNA序列，用于构建p15?pcDNA3.1质粒载体，产物在1%琼脂糖下电泳，可见约465 bp处有一阳性条带，片段大小与设计的p15基因全长cDNA序列大小一致；同时以相同引物从K562细胞扩增出与p15基因片段大小相似的DNA片段 (图1)。
Figure 1. p15 gene amplified from PBMNC and K562 by RT?PCR. Lane 1: DGL2000 DNA marker. Lane 2: p15 gene amplified from peripheral blood mononuclear cells（about 465 bp）. Lane 3: p15 gene amplified from K562 cells.
重组质粒的构建
将从外周血单个核细胞扩增的 p15 基因全长 cDNA 序列及pcDNA3.1质粒分别用HindⅢ和EcoRI酶切，形成黏性末端后以 T4 连接酶连接， 构建p15?pcDNA3.1重组质粒，将重组质粒用HindⅢ和EcoRI酶切鉴定，约465 bp处可见酶切的DNA片段，大小与p15基因的全长cDNA大小序列一致（图2）。
p15基因序列分析
将从外周血单个核细胞扩增的p15基因全长cDNA序列及puc18?T测序载体分别用HindⅢ和EcoRI酶切，形成黏性末端后以T4连接酶连接，构建p15?puc18?T重组T载体，将与T载体连接的p15基因用通用引物测序。将测序结果通过BLAST程序进行核苷酸序列对比检索，结果证实从外周血单个核细胞扩增的p15基因测序结果与GenBank上的p15基因全长cDNA序列完全一致（图3）；但从K562细胞中扩增的DNA片段，将其测序结果用GenBank的blAST分析后，发现在第174-180位点有7个碱基缺失（图4），证实在K562细胞中p15基因存在部分基因缺失。
表达p15基因的细胞株K562?P21?pcDNA3.1的建立
将重组构建的 p15?pcDNA3.1 真核表达载体转染K562细胞。此载体含有真核启动子及正确的p15基因全长cDNA,能够表达P15蛋白，经G418筛选2周后形成稳定表达P15蛋白的p15?K562?pcDNA3.1细胞株。经过Western blot检测证实此细胞株有P15蛋白的高效表达，同时检测到此细胞株中cyclin D1蛋白表达降低，在蛋白定量一致情况下，以各细胞表达量一致的β?actin蛋白作为内参照（图5）。
流式细胞术结果分析表明，正常对照K562细胞为高S期细胞，各期细胞比例为： G1期30.2%,S期57.4%,G2/M期12.3%；转染P15?pcDNA3.1质粒后K562细胞周期分布为： G1期53.8%, S期37.6%,G2/M期8.6%, 说明P15通过细胞周期G1期阻滞抑制细胞生长，使进入S期细胞减少。转染p15基因未出现凋亡峰。伊马替尼浓度大于0.5 μmol/L时作用K562细胞48小时后出现凋亡峰，且随剂量增大，凋亡比例增加，呈现剂量依赖性，取0.25 μmol/L浓度的伊马替尼作用于K562细胞48小时后未出现凋亡峰，细胞周期分布为：G1期76.6%,S期21.2%,G2/M期2.2%，将此浓度的伊马替尼加入转染 p15?pcDNA3.1重组载体的K562细胞，48小时后能够诱导出明显的凋亡峰(凋亡比例24.8%)，S期细胞比例明显下降(12.6%)，说明联合应用伊马替尼和p15?pcDNA3.1载体对诱导K562细胞凋亡及抑制DNA合成方面具有协同作用（图6）。
转染p15?pcDNA3.1细胞生长状况
MTT法检测显示K562细胞增殖速度极快，群体倍增时间约为18-24小时，转染pcDNA3.1空载体的K562细胞与对照K562细胞相比，细胞增殖速度无明显变化，而转染p15?pcDNA3.1重组质粒的K562细胞生长速度较对照细胞明显减慢，群体倍增时间约为48-60小时，说明p15能抑制K562细胞增殖。伊马替尼对K562细胞增殖亦有抑制作用；转染p15?pcDNA3.1的K562细胞与伊马替尼联合应用后其细胞存活率与单纯加入伊马替尼的未转染K562细胞及单纯转染p15?pcDNA3.1的K562相比均降低，说明p15联合伊马替尼对K562细胞增殖抑制具有协同作用（图7）。
讨 论
p15基因属于细胞周期素依赖激酶抑制物中INK4（inhibitor of CDK4 and CDK6）家族，其编码的蛋白是CDK抑制蛋白家族中重要成员，可特异性抑制cyclin D?CDK4/6复合物的磷酸化激酶活性。
p15基因在白血病细胞中存在基因缺失、突变及甲基化失活等形式，而且其缺失、突变、失活等在急性淋巴细胞白血病中容易发生，而在髓系白血病中较少发生，在绝大多数CML慢性期患者中，很少检测到p15基因的异常；CML患者即使发生向淋巴细胞方向急性变，也很少检测出p15基因的缺失。本实验证实，CML向髓系急性变时也存在p15基因部分缺失；由于其缺失位点处于p15基因cDNA序列中间，因而导致此缺失部位以后的碱基翻译的氨基酸序列完全不同于P15蛋白，即突变后转录出变性的P15蛋白，不具有抑制CDK4/CDK6活性的能力，也无其它功能，由此可以推论K562细胞中缺乏具有正常功能的P15蛋白，这可能也是K562细胞恶性增殖的原因之一。因而，转染外源性p15基因至K562细胞，可以部分纠正由于P15蛋白失常导致的细胞周期失控，抑制细胞恶性增殖。
由于p15基因较p53、p21、p15等基因小，特异性强，直接作用于细胞周期的启动因子cyclin D/CDK4/CDK6复合物，起效快，因而将外源性p15基因转染入p15基因突变的细胞系，更能发挥良好的抗白血病效应，因此它成为近来白血病基因研究的一个热点。将伊马替尼与p15基因联合治疗慢性粒细胞白血病，也是一个新的有益尝试。目前认为， p15基因和凋亡呈正相关，并且凋亡的发生与细胞周期阻滞、增殖抑制也呈正相关，即p15基因的表达可以使细胞阻滞于G1期，进入S期的细胞大量减少，细胞增殖受抑，同时启动凋亡程序加速凋亡。p15基因属于bcr?abl融合基因调控的下游基因， bcr?abl能下调P15蛋白和mRNA的水平，主要通过PI3K途径，而伊马替尼不仅能阻止bcr?abl引起的p15下调，还能诱导p15蛋白表达增加，主要原因是抑制了PI3K信号通路，同时引起P15蛋白降解减慢，同时发现伊马替尼能抑制多种细胞周期蛋白（如cyclin D、cyclin E等）的表达，而cyclin D是P15蛋白的抑制物，故它减弱了对P15蛋白的抑制。因此，转染p15基因不仅在K562细胞中重建了p15基因调节的细胞周期通路，而且伊马替尼与p15基因克隆联合应用后加强了对K562细胞的凋亡诱导作用，表现出协同效应。
由于联合应用p15基因克隆和伊马替尼后细胞周期调节作用明显，细胞增殖能力明显降低，同时凋亡比例明显上升，因此联合伊马替尼及p15基因治疗应用于CML临床有较好的前景和意义。
【】
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