巢式MSP法检测急性白血病患者p16基因甲基化状态
作者：范丽萍 沈建箴 叶宝国 林福安 傅海英 周华蓉 沈松菲 喻爱芳
【摘要】 为了研究p16基因甲基化和缺失与急性白血病发病的关系，探讨其在成人急性白血病发生中的生物学意义，应用巢式甲基化特异性聚合酶链反应（nested methylation specific polymerase chain reaction，n?MSP）分析了82例各种亚型的急性白血病患者在初诊或复发不同阶段p16基因的甲基化和缺失状态，并且在基因组硫化修饰PCR后克隆测序验证结果的准确性。结果表明: 82例急性白血病（AL）患者p16基因甲基化的出现率为39.0％,其中急性髓系白血病(AML)患者为41.4％,24例急性淋巴细胞白血病（ALL）患者为33.3％；初治AL患者为36.6％，而复发患者则为54.5％。82例AL患者中有6例p16基因缺失，缺失率为7.3%，在AML、ALL患者中分别为1.7％和20.8％。16例健康自愿者或非恶性血液病患者p16基因则未发生甲基化或缺失。结论:在成人急性白血病的发生发展中，p16基因甲基化比p16基因纯合缺失更具有意义；p16基因表达异常与成人急性白血病的发生发展密切相关。
【关键词】 p16基因; 基因甲基化; 急性白血病; n?MSP
Detection of p16 Gene Methylation Status in Adult Patients with Acute Leukemia by Using n?MSP
Abstract The study was aimed to explore the relationship between patterns of methylation or deletion and the development of acute leukemia, and further to clarify the possible mechanism in the development of adult acute leukemia. Nested methylation?specific polymerase chain reaction (n?MSP) was adopted to analyze p16 gene methylation or deletion patterns in 82 adult acute leukemia patients with different subtypes and stages. The results indicated that rate of p16 gene methylation was 39.0% in 82 adult acute leukemia patients, among them, 41.4% in acute myelogenous leukemia (AML) and 33.3% in acute lymphoblastic leukemia(ALL).It were found that 36.6％of de novo AL patients and 54.5% of relapsed AL patients developed the hypermethylation of p16 gene. Out of the 82 patients， 6 seemed to have deletion of p16 gene, including 1 AML（1.7％） and 5 ALL(20.8％). There were no hypermethylation or deletion of p16 gene in the 16 controls. It is concluded that methylation of p16 gene may play a more important role than homozygous deletion of p16 gene in the leukemogenesis and progression of adult acute leukemia．
Key words p16 gene; gene methylation; acute leukemia; n?MSP
p16基因由Kamb于1994年在对近300株细胞进行检测时发现［1］，它位于染色体9p21，其编码产物P16蛋白属于CKI中的INK4家族，通过与cyclin?D竞争与CDK4、6的结合而在细胞周期调控中发挥着重要的负调控作用。传统的观点认为，基因的缺失和突变是基因失活的主要方式；近年来研究显示，基因甲基化所导致的基因沉默亦是基因失活的方式之一，在多种恶性血液病中，p16基因发生异常的主要途径是基因缺失和基因异常甲基化。目前分析DNA甲基化最常用的方法是甲基化特异性PCR（MSP）， 在这种方法的基础上诞生的改进方法即巢式甲基化特异性PCR（nMSP）具有更高的灵敏度和特异性，可以检测出1/50 000的甲基化等位片段［2］,很适合用于 p16 基因启动子区甲基化的检测。
材料和方法
标本的收集
福建医科大学附属协和和漳州市医院收治的急性白血病患者共82例，男性49例，女33例，中位年龄34.0(14-74)岁。其中急性髓系白血病(AML)58例（包括49例初治和9例复发）,急性淋巴细胞白血病(ALL)24例（包括22例初治和2例复发）。所有病例均符合急性白血病的诊断标准［3］。对照组16例（包括10例健康自愿者和6例非恶性血液病患者）。收集患者和对照者的骨髓和外周血标本。
试剂和仪器
蛋白酶K、RNA酶、DNA修饰药物亚硫酸氢钠，氢醌（对苯二酚）等试剂购自Sigma公司，淋巴细胞分离液、酚?氯仿DNA抽提液为上海生物工程公司产品，Wizard DNA树酯纯化柱为Promega公司产品， DNA Marker 1购自厦门泰晶生物有限公司，普通热启动Taq为酶TaKaRa公司产品。所用仪器:37℃、饱和湿度、5% CO2培养箱（Heal Force）、2720 Thermal Cycler（Applied Biosystems,Version 2.08）、紫外分光光度仪(美国贝克曼公司产品，DU?640型)、凝胶成像仪(BIO?RAD公司产品，Gel Doc 1000型)。
引物序列
PCR引物由上海生物工程公司合成，序列见表1。
基因组DNA的提取、修饰及纯化
肝素抗凝骨髓或外周血经淋巴细胞分离液分离单个核细胞，常规酚?氯仿提取细胞基因组DNA用去离子水溶解后于-20℃保存。基因组DNA的亚硫酸盐修饰：Herman等［4］的方法，取1-2 μg DNA，加超纯水至50 μl。加3 mol/L的 NaOH 5.5 μl，37℃ 放 10分钟。向碱变性的DNA中加入新配置的30 μl 10 mmol/L 的氢醌和520 μl 3 mol/L亚硫酸氢钠, 以矿物油3滴覆盖液面，50℃放置16到18小时。再用Wizard DNA Clean?Up System 纯化，纯化后的DNA加5.5 μl 3 mol/L的NaOH，室温放置15分钟，用预冷的乙醇沉淀DNA，并以30 μl超纯水溶解，-20℃储存备用。
巢式甲基化特异性PCR扩增
按参考［2］报道的方法进行第1轮巢式MSP反应扩增1段p16基因启动子区富含CG的序列，片段长度为280 bp，p16F1和p16F2这对引物只识别亚硫酸盐修饰后的模板，而不能区分甲基化和非甲基化的等位基因。将第1轮PCR产物稀释30倍，取2 μl作为第2轮巢式MSP反应的模板，第2轮巢式PCR使用的引物分别是是甲基化（p16M1,p16 M2）和非甲基化(p16U1, p16U2)特异性引物，第1轮和第2轮巢式PCR的引物序列见表1。两轮巢式PCR反应的体系均为25 μl，其中10×Buffer（Tris?HCl 100 mmol/L、KCl 500 mmol/L、MgCl2 15 mmol/L） 2.5 μl，2.5 mmol/L dNTP 2 μl,各引物10 pmol， Taq DNA聚合酶0.6 U，模板DNA 50 ng。PCR扩增在2720 Thermal Cycler上进行，反应步骤如下：95℃预变性 10分钟，然后95℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后72℃再延伸10分钟。第2轮巢式MSP分别使用非甲基化引物p16U1、p16U2和甲基化引物p16M1、p16M2进行扩增，除引物外反应体系其它部分与第1轮相同，反应条件与第1轮不同的是非甲基化引物退火温度为61℃，甲基化引物退火温度为66℃。同时，以正常人外周血淋巴细胞DNA为阴性对照，水作空白对照。最后取8 μl PCR产物在2％的琼脂糖凝胶上电泳，在Gel Doc 1000型凝胶图像分析仪上观察并照相。
PCR产物的序列分析
从第2轮巢式MSP甲基化和非甲基化引物扩增出的随机产物中挑选2个随机产物，由上海博亚生物技术有限公司克隆后进行序列分析。
统计学分析
数据应用SPSS 11.5机软件进行统计学处理,两组间率的比较采用χ2检验精确概率法统计。
结 果
急性白血病患者p16基因甲基化情况
82例AL患者总的p16基因甲基化检出率为39%（32/82），其中AML的检出率为41.4%（24/58）,ALL的检出率为33.3%（24/58）,AML与ALL无统计学差别；71例初治患者中p16基因甲基化的检出率为36.6%（26/71），11例复发患者检出率为54.5%（6/11）；正常对照及非恶性血液病患者则均未发现p16基因甲基化（表2）。
急性白血病患者p16基因的缺失情况
82例患者中有6例发生p16基因缺失，其缺失率为7.3%，其中5例为ALL，而AML仅有1例，ALL、AML的缺失率分别为20.8％和1.7％。正常对照及非恶性血液病患者则均未发现p16基因缺失（表3）。
MSP扩增结果
由图1可见，患者D6、D22扩增出150 bp的M片段和U片段，说明发生部分甲基化，且为高甲基化；而患者D1、D7只扩增出151 bp大小的U片段，为非甲基化；正常人p16基因也只扩增出151 bp大小的U片段，为非甲基化；患者D4未扩增出M、U条带，发生了p16基因的缺失。
MSP分析的可靠性
为证实MSP分析可靠性，我们随机挑选了2个分别用P16M和P16U引物扩增的PCR产物，经克隆后测序，结果见图2，这证明第二轮MSP产物是p16基因启动子区的部分序列，其分析结果完全可靠。甲基化的p16基因其CpG中的C未被硫化改变，仍为C。而非甲基化序列没有C，其C经修饰后转变成T。两结果对比证实，有CpG二核苷酸存在于序列中则为甲基化的CpG，而有TpG存在于序列中则为非甲基化的CpG。
以上测序结果显示p16基因启动子5′ 端片段，非甲基化片段中所有的胞嘧啶都转变成胸腺嘧啶，甲基化片段中CpG 二核苷酸的胞嘧啶保持不变。
讨 论
已有证据表明，人类癌症的过程与抑癌基因启动子高甲基化及癌基因启动子低甲基化有关。p16基因是目前已知大多数肿瘤中失活频率最高的肿瘤抑制基因之一，其启动子区甲基化在许多肿瘤中都是一个早发和频发事件。在多种恶性血液病中，p16基因发生异常的主要途径是基因缺失和基因异常甲基化。近几年国内外大量研究证明,p16基因CpG岛的甲基化与白血病有密切关系。Guo等［5］的研究显示，急性白血病中p16基因甲基化发生率较高, 38%的AML患者有p16基因的甲基化。Hoshino等［6］报道，23%的ALL存在p16基因的甲基化，16%的ALL存在p16基因的纯合缺失。国内学者也有报道应用MSP法检测出12.5%的AL患者p16基因存在甲基化［7］。我们课题组前期用甲基化敏感限制性内切酶法检测出24%的AL患者有p16基因甲基化。本实验中采用n?MSP法对不同类型的急性白血病的p16基因CPG岛甲基化异常进行了研究,结果显示,39%的初治或复发急性的白血病患者均有p16基因CpG岛的甲基化,ALL（33.3%）与AML（41.4%）之间无显著差异，与报道的基本一致。Kamb等［1］在对近300个肿瘤细胞系研究时发现p16普遍缺失，在星母细胞瘤细胞系中缺失达82％，胸部肿瘤和骨肉瘤中达60％，肺癌中达58％，白血病中的缺失达25％。本组82例成人急性白血病中，p16缺失6例，其中5例为ALL，AML仅见1例。缺失率占ALL的20.8％(5／24)，占AL的7.32％ (6／82)，提示p16基因纯合缺失在成人急性白血病中发生率较低，且主要发生于ALL患者，其基因失活主要方式为p16基因CpG岛的甲基化。在71例初治及11例复发的AL患者中p16基因的甲基化率分别为36.6%和54.5%，看来在复发患者中p16基因甲基化的发生率似更高，提示p16基因甲基化可能与白血病的预后相关，但有待进一步研究实证。实验证明在AL发生、发展过程中,p16 基因CpG岛甲基化起着重要作用。
p16基因在细胞周期的调控中起关键性负调控作用，其基因产物p16蛋白主要抑制CDK4介导的Rb基因蛋白产物的磷酸化，阻止细胞从G1期进入S期。当p16基因5′端CpG岛发生异常甲基化时，导致基因转录失活，表达封闭，不能发挥细胞周期负调控作用，从而导致肿瘤细胞的恶性增殖。多种研究发现这种甲基化修饰可以被药物逆转。目前，去甲基化药物已经用于恶性血液病的临床，已经成为诱导分化和抑制增殖的新途径。本实验结果表明，p16基因甲基化在AL的发生、发展中有一定的指导意义。去甲基化药剂可以为急性白血病的治疗提供了一个新的选择。
同时，巢式MSP法检测甲基化,方法简便易行,结果可靠,在检测DNA甲基化方面得到广泛的应用。我们课题组前期已经应用巢式p16MSP方法对恶性血液病细胞株的甲基化状态进行了检测，并且证实了巢式MSP相对于普通的MSP有较高的敏感性和特异性［8］，它不仅可用来探讨甲基化的发生与白血病发病的关系,还可能用于AL的辅助诊断、微量残留病灶的检测和去甲基化药物疗效监测等方面。
【文献】
1Kamb A, Gruis NA, Weaver?Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science，1994; 264(5157):436-440
2Palmisano WA, Divine KK, Saccomanno G, et al. Predicting lung cancer by detecting aberrant promoter methylation in sputum. Cancer Res, 2000; 60: 5954 - 5958
3张之南.血液病诊断及疗效标准.第2版.北京:出版社,1999:168-179
4Herman JG, Graff JR, Myohanen S, et al. Methylation?specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG island. Proc Natl Acad Sci USA, 1996; 93: 9821 - 9826
5Guo SX, Taki T, Ohnishi H, et al. Hypermethylation of p16 and p15 genes and RB protein expression in acute leukemia. Leuk Res, 2000; 24: 39-46
6Hoshino K, Asou N,Okubo T, et al. The absence of the p15INK4B gene alterations in adult patients with precursor B?cell acute lymphoblastic leukaemia is a favourable prognostic factor. Br J Haematol, 2002;117: 531-540
7孟月生，于海英，郭成山等. 急性白血病患者p15与p16基因甲基化检测及mRNA表达水平的定量分析.中华血液学杂志, 2005; 26: 434-435
8周华蓉,沈建箴,付海英等. 巢式MSP法检测恶性血液病细胞株p16基因启动子甲基化状态的研究. 实验血液学杂志, 2006;14: 375-378??
