K562和K562/AO2细胞HLA I 类分子与MICA/B的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响
作者：梅家转 牛新清 郭坤元 周健 魏红梅
【摘要】 本研究探讨K562亲本细胞株及多药耐药细胞株K562/AO2细胞表面HLA I 类分子和MHC I 类链相关分子（MICA/B）的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响。用流式细胞仪检测K562和K562/AO2细胞株HLA I类分子和MICA/B的表达情况；LDH释放法测定3例健康人NK细胞在不同效靶比时对K562和K562/AO2细胞的杀伤活性；效靶比10∶1时，用抗HLA I 类分子单克隆抗体（W6/32）和抗MICA/B单克隆抗体（BAMO?1）分别封闭MHC Ⅰ类分子和MICA/B，观察NK细胞杀伤K562及K562/AO2细胞活性的变化。结果表明： K562和K562/AO2细胞均不表达HLA I 类分子，K562细胞的MICA/B表达较K562/AO2明显增高（P<0.01）。效靶比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1时NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性分别为 (29.32±0.12)%、(45.33±0.78 )%、(58.37± 0.87)%、(72.37±0.96)和(12.47±0.91)%、(24.36±1.11)%、(33.29±1.03)%、(53.87 ±1.27)%，各效靶比时NK细胞对K562细胞的杀伤活性较K562/ AO2细胞明显增强（P=0.000）；效靶比10∶1时W6/32不抑制NK细胞杀伤K562和K562 /AO2细胞的活性，BAMO?1能明显抑制NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性。结论： MICA/B在K562和K562/AO2细胞表达的差异与NK细胞的杀伤活性有关；NK细胞对K562/AO2细胞杀伤活性降低与HLA I类分子无关；MICA/B在多药耐药肿瘤细胞的低表达导致耐药肿瘤细胞对NK细胞杀伤敏感性下降。
【关键词】 杀伤细胞; MHC I 类链相关分子A/B; K562细胞
Expression of HLA Class I Molecules and MHC Class I Chain?related Molecules A/B in K562 and K562/AO2 Cell Lines and Their Effects on Cytotoxicity of NK Cells
Abstract The study was aimed to investigate the expression of HLA class I molecules and MHC class I chain?related molecules A/B (MICA/MICB) in K562 and adriamycin (ADM)?resistant K562 cell lines (K562/AO2) and their effect on cytotoxicity of NK cells. Expression of HLA class I molecules and MICA/MICB on the surface of K562 and K562/AO2 cell lines were analyzed by flow cytometry. Cytotoxicity of NK cells (isolated from 3 healthy persons) against K562 and K562/AO2 cells were detected by LDH releasing assay at different effect?to?target cell ratios (E∶T). In blocking experiments, anti?MHC class I monoclonal antibody (McAb) (W6/32, a pan anti?HLA class I antibody) and anti?MHC class I chain?related molecules McAb (BAMO?1, specificly against MICA and MICB) were added to the target cells at E∶T of 10∶1. The results showed that the expression of MHC class I chain?related molecules on K562 was higher than that on K562/AO2 (P=0.000), and HLA class I molecules were not detectable on both cells. Cytotoxicities of NK cells against K562 and K562/AO2 cells were (29.32±0.12)%, (45.33± 0.78)%, (58.37±0.87)%, (72.37±0.96)% and (12.47± 0.91)%, (24.36± 1.11)%, (33.29±1.03)%, (53.87± 1.27)% at E∶T ratios of 5∶1,10∶1, 20∶1 and 30∶1 respectively (P=0.000), the cytotoxicity of NK cells on K562 cells was signficantly higher than that on K562/A02 cells at different E∶T ratios. Blocking experiments confirmed that at E∶T of 10∶1 killing of NK cells against K562 and K562/AO2 cells was efficiently inhibited by BAMO?1, whereas W6/32 had no effect on K562 and K562/AO2 cells. It is concluded that the expression of MHC class I chain?related molecules on K562 and K562/AO2 cells is correlated with NK cell?mediated lysis. NK cells display higher cytotoxicity against parental K562 cells than multi?drug resistant K562/AO2 cells. Down?regulation of MICA/B in multi?drug resistant tumor cell lines leads to reduction of susceptibility to NK lysis.
Key words natural killer cells; MICA/B； K562 cell
耐药肿瘤细胞的存在和其无限生长是肿瘤失败的主要原因，多年来虽然人们对肿瘤多药耐药的机制和耐药逆转剂进行了深入的研究，但由于逆转剂的严重毒副作用而限制了其在临床的应用，因而肿瘤的生物治疗日益得到医学研究者的关注，NK细胞作为生物治疗的新手段逐渐被重视。NK细胞对靶细胞的杀伤活性与其细胞表面的活化性受体和靶细胞表面的配体密切相关，靶细胞表面的HLA I 类分子及MHC I 类链相关基因产物（MICA/B）是影响NK细胞杀伤活性的主要分子。本研究通过流式细胞分析技术探讨HLA I 类分子及MICA/B在K562亲本细胞株及多药耐药细胞株K562/AO2的表达情况，进一步了解其对NK细胞杀伤活性的影响。
材料
NK细胞分离缓冲液（磷酸盐缓冲液， pH 7.2，含0.5% BSA和2 mmol/L EDTA）为Miltenyi Biotec公司产品，CD56MicroBeads为Miltenyi Biotec公司产品，抗MICA/MICB单克隆抗体(BAMO?1, IgG1)由德国Alexander Steinle教授惠赠，FITC标记的鼠抗人HLA I类分子单克隆抗体（W6/32, IgG2a）和FITC标记的山羊抗小鼠IgG1为eBioscience公司产品，RPMI 1640为Gibco公司产品，淋巴细胞分离液购于上海试剂二厂，rhIL?2购于上海华新公司，NK细胞杀伤活性检测试剂盒(Cytotox96 Non?Radioactive Cytotoxocity Assay）为Promega公司产品，流式细胞仪为Coulter公司产品。K562细胞株为本室冻存株，K562/AO2细胞株由医学院血液学研究所用阿霉素（adriamycin, ADM）对K562细胞长期诱导建株［1］，K562/AO2细胞对ADM、长春新碱、高三尖杉酯碱等都有较强的耐药性，多药耐药相关蛋白P170表达阳性。
NK细胞分离纯化
采用常规的密度梯度离心法分离3名健康人的外周血单个核细胞，用PBS洗涤2次，计数细胞，CD56MicroBeads作MACS细胞阳性分选, 获得CD3-CD56+细胞，流式细胞仪检测CD3-CD16+CD56+细胞的纯度。
细胞培养
细胞培养液为含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI 1640。培养NK细胞时加入1000 U/ml的rhIL?2，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养24小时。
K562、K562/AO2 细胞表面HLA I 类分子和MICA/B的测定
收集对数期生长的K562、K562/AO2细胞，用PBS洗涤2次，计数细胞，分管；检测HLA I类分子时，按1 μg/106细胞浓度加入W6/32，4℃孵育30分钟，用PBS洗涤3次，用流式细胞仪分析样本中1×104个细胞中HLA I 类分子阳性细胞数，荧光标记阳性细胞的百分率。应用间接标记法检测MICA/B的表达，加入BAMO?1一抗，4℃作用30分钟，PBS洗涤后再加入FITC标记的山羊抗鼠IgG1二抗，4℃孵育30分钟，经PBS洗涤后上机分析。同型IgG1(PharMingen公司)作为阴性对照抗体。为减少误差，重复实验3次。
NK细胞杀伤活性测定
采用4小时LDH释放测定法，参照Cytotox96 Non?Radioactive Cytotoxocity Assay 说明书操作。抗体封闭试验采用效靶比10∶1时，用10 μg/ml的BAMO?1、W6/32分别与靶细胞室温孵育15分钟，封闭MHC Ⅰ类分子及MICA/B，然后再加入NK细胞测杀伤率。
NK细胞杀伤活性(%)=(实验组平均OD值－靶细胞释放组平均OD值－效应细胞自然释放组平均OD值)/(靶细胞最大释放组平均OD值－靶细胞自然释放组平均OD值)×100%
统计学处理
应用SPSS 10.0软件进行数据处理，采用独立样本t检验。MHC I类链相关分子的表达与NK细胞对靶细胞杀伤活性的相关性分析采用双变量相关分析Spearman法。
结 果
NK细胞的纯度
流式细胞仪检测CD3-CD16+CD56+细胞的纯度达90%以上。
K562、K562/AO2细胞表面HLA I 类分子和MICA/B的表达 NK细胞杀伤活性
NK细胞杀伤K562、K562/AO2细胞的活性在效靶比5∶1时分别为(29.32±0.12)%、(12.47±0.91)%；效靶比10∶1时分别为(45.33±0.78)%、(24.36±1.11)%；效靶比20∶1时分别为(58.37±0.87)%、(33.29±1.03)%；效靶比30∶1时分别为(72.37±0.96)%、(53.87±1.27)%。各效靶比时NK细胞对K562细胞的杀伤活性较 K562 /AO2细胞明显增强（P=0.000）（图1）；效靶比10∶1时用BAMO?1封闭MICA/B后，NK细胞对K562、K562/ AO2细胞的杀伤活性分别为(33.67±1.58)%、(16.98±0.41)%，均较阻断前明显降低（P=0.000）。W6/32封闭K562、K562 /AO2细胞HLA I 类分子后，NK细胞对K562、K562/AO2细胞杀伤活性分别为(44.37±1.17)%、(24.29±1.42)%，与阻断前相比均无显著性差异（P>0.05）（图2）。
MICA/B表达率与NK细胞对K562、K562/AO2细胞杀伤活性的相关性分析
双变量相关分析结果表明，不同效靶比时NK细胞对K562、K562/AO2细胞的杀伤活性与细胞表面的MHC I 类链相关分子的表达均相关，在效靶比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1时相关系数分别为0.997（P=0.000）、0.997（P=0.000）、0.998（P=0.000）、0.996（P=0.000）。
讨 论
NK细胞是机体抗肿瘤的第一道防线，NK细胞对靶细胞的杀伤活性与其细胞表面的活化性受体和靶细胞表面的配体密切相关，靶细胞表面HLA I 类分子及MICA/B是影响NK细胞杀伤活性的主要分子。
NKG2D是1991年Houchins等［2］在NK细胞中发现的，NKG2D除表达在所有NK细胞上外，在绝大多数γδ T 细胞、CD8 +αβ T细胞上也有表达［3］。MHC I 类链相关基因产物（MICA，MICB）属于非经典的HLA I 类基因,集中表达在胃肠道上皮细胞中,在大多数上皮性肿瘤组织中如肺癌、乳腺癌、肾癌及卵巢癌、结肠癌等也有表达，是NKG2D的主要活化性配体。
研究表明，肿瘤细胞的MHC I 类分子丢失或变异使特异性MHC限制性的细胞毒性T细胞不能发挥作用，在这种情况下，识别非MHC I 类分子的NKG2D在介导NK细胞识别和溶解肿瘤细胞的免疫反应中发挥关键作用［4］。NKG2D通过与靶细胞表面相应的配体结合,然后通过结合转接蛋白DAP?10传递活化信号，激活NK细胞获得攻击靶细胞的能力［5］，另外还可能为CD8+ T细胞提供必要的协同刺激信号，因而在很大程度上NKG2D的活化决定了机体的抗肿瘤细胞免疫水平。
本研究对MHC I 类链相关分子的表达情况进行了检测,结果显示K562、K562/AO2细胞均表达MICA/B。K562细胞表面MICA/B的表达率较K562/AO2细胞明显增强，杀伤实验表明NK细胞对K562细胞的杀伤活性较K562/AO2细胞增强。相关分析亦表明，不同效靶比时NK细胞对K562、K562/AO2细胞的杀伤活性与细胞表面的MICA/B的表达率均相关。单克隆抗体阻断实验证明，anti?MICA/MICB可不同程度地抑制NK细胞对K562、K562/AO2的杀伤活性，说明MICA、MICB影响NK细胞对K562、K562/AO2细胞的杀伤作用。
有研究表明，耐药肿瘤细胞表面HLA I 类分子表达增高从而导致对NK细胞的杀伤活性减弱［6］。本研究表明，K562、K562/AO2细胞表面均不表达HLA I 类分子，anti?HLA I类分子单克隆抗体封闭K562、K562/AO2细胞表面的相应位点不影响NK细胞的杀伤活性，说明NK细胞对K562/AO2细胞杀伤活性的减低与HLA I 类分子表达无关。
本研究结果表明，NK细胞对耐药细胞株的杀伤活性减弱是由于MICA/B在耐药细胞表面的低表达所致，提示我们肿瘤在发生多药耐药的同时获得了免疫逃避能力。
【】
1栾风君, 杨纯正, 马建国等. 一株红白血病多药耐药细胞系(K562/AO2)的建立及其耐药特性的研究 . 中华肿瘤杂志, 1993； 15: 101-103
2Houchins JP, Yabe T, McSherry C, et al. DNA sequence analysis of NKG2, a family of related cDNA clones encoding type II integral membrane proteins on human natural killer cells . J Exp Med, 1991； 173: 1017-1020
3Bauer S, Groh V, Wu J, et al. Activation of NK cells and T cells by NKG2D, a receptor for stress inducible MICA . Science, 1999； 285（5428）: 727-729
4Jamieson AM, Diefenbach A, McMahon CW, et al. The role of the NKG2D immunoreceptor in immune cell activation and natural kil?ling. Immunity, 2002； 17: 19-29
5Farag SS, Fehniger TA, Ruggeri L, et al. Natural killer cell receptors: new biology and insights into the graft?versus?leukemia effect . Blood, 2002； 100:1935-1947
6Classen CF, Falk CS, Friesen C, et al. Natural killer resistance of a drug?resistant leukemia cell line, mediated by up?regulation of HLA class I expression. Haematologica, 2003； 88: 509-521
