人红细胞冻干前负载海藻糖最佳化研究
作者：庄远 刘景汉 欧阳锡林 陈麟凤 车辑
【摘要】 为更好的实现海藻糖在红细胞冻干保存中的保护作用，关键是克服质膜对海藻糖的非渗透性，使胞质内海藻糖达到有效浓度。本研究的目的是通过对人红细胞负载海藻糖的性研究，筛选出海藻糖负载的最佳负载条件并评价海藻糖负载对红细胞各项理化指标的影响。在不同孵育温度（4、22和37℃）、孵育时间（0、2、4、6、8、10小时）、不同负载缓冲液浓度（0、200、400、600、800、1 000 mmol/L）条件下检测新鲜红细胞对海藻糖的成功负载量及红细胞各项理化指标；在固定负载条件下，对新鲜红细胞和4℃保存72小时红细胞海藻糖负载、游离血红蛋白（FHb）、血红蛋白(Hb)和红细胞平均体积（MCV）进行了比较。结果表明：红细胞对海藻糖的负载与孵育温度、时间及负载缓冲液海藻糖浓度密切相关。随着温度的升高、时间的延长和负载缓冲液海藻糖浓度的增加，红细胞对海藻糖的摄取量也随之增加。在海藻糖负载最佳条件下，新鲜红细胞和4℃保存72小时红细胞的胞内海藻糖浓度、FHb浓度分别为65.505±6.314 mmol/L、66.2±5.002 mmol/L和6.567±2.568 g/L、16.168±3.922 g/L。结论：红细胞负载海藻糖的最佳条件是采用新鲜红细胞，在37℃条件下、海藻糖浓度为800 mmol/L的负载缓冲液中孵育8小时，这一条件可使胞内海藻糖达到有效浓度，并保持红细胞细胞理化性质稳定和膜完整性。
【关键词】 红细胞冻干；海藻糖；负载缓冲液
Optimization of Trehalose Loading in Red Blood Cells before Freeze?drying
Abstract The key points for better protection of trehalose in freeze?drying red blood cells (RBCs) are to resolve non?osmosis of trehalose to red blood cells and to make cytoplasmic trehalose to reach effective concentration. This study was aimed to investigate the regularity of loading RBCs with trehalose, screen out optimal loading condition and evaluate the effect of trehalose on physico-chemical parametes of RBCs during the period of loading. The cytoplasmic trehalose concentration in red blood cells, free hemoglobin and ATP level were determined at different incubation temperatures (4, 22 and 37℃), different trehaolse concentrations (0, 200, 400, 600, 800 and 1000 mmol/L ) and different incubation times (2, 4, 6, 8 and 10 hours), the cytoplasmic trehalose, free hemoglobin (FHb), hemoglobin (Hb) and mean corpuscular volume (MCV) in fresh RBCs and RBCs strored for 72 hours at 4℃ were compared, when loading condition was ensured. The results showed that with increase of incubation temperature, time and extracellular trehalose concentration, the loading of trehalose in RBCs also increased. Under the optimal loading condition,cytoplasmic trehalose concentration and free hemoglobin level of fresh RBCs and RBCs stored for 72 hours at 4℃ were 65.505±6.314 mmol/L, 66.2±5.002 mmol/L and 6.567±2.568 g/L, 16.168±3.922 g/L respectively. It is concluded that the most optimal condition of loading trehalose is that fresh RBCs incubate in 800 mmol/L trehalose solution for 8 hours at 37℃. This condition can result in a efficient cytoplasmic trehalose concentration . The study provides an important basis for long?term preservation of RBCs.
Key words freeze?drying of red blood cells; trehalose; loading solution
与传统的血液保存方法相比，冻干红细胞具有很多优点：室温下样品性质稳定、容易再水化、重量大大减轻，易于运输及便于消毒处理，所以冻干保存有可能成为最有效的红细胞长期保存方法。维持红细胞胞膜完整性是红细胞冻干成功的关键点和难点。在慎重选择红细胞膜的冻干保护剂基础上，必须最大程度发挥冻干保护剂的作用。海藻糖作为细胞保存中首选的保护剂有着不同于其它保护剂的独特作用，在干燥、失水、冷冻、高温、高湿等情况下对生物体或活性分子具有明显的保护作用， 因而被广泛用于细胞保存研究。但由于胞膜对海藻糖的非渗透性，所以一般情况下海藻糖不能透过细胞膜。然而，越来越多的研究显示，只有海藻糖进入细胞内部，在冻干时才能对细胞膜和胞内蛋白起到有效的保护作用［1］。因此，红细胞的海藻糖负载既要保证胞内海藻糖达到一定浓度，又要最大限度地避免红细胞损伤。本实验系统地研究了红细胞对海藻糖的负载规律，并对红细胞在此过程中受到的损伤进行了探讨，从而为今后更好地将海藻糖应用于红细胞的冻干保存打下基础。
实验试剂与仪器
海藻糖（纯度≥99％）购于南宁中诺生物工程有限责任公司。三氯乙酸、浓硫酸购自北京化工厂。ATP荧光素酶－荧光素粉剂为院上海植物生理研究所研制的产品。蒽酮为北京金龙化学试剂公司产品。如果没有特殊说明，所有的试剂均是分析级。
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（300 mOsm, pH 7.2）由154 mmol/L NaCl, 1.06 mmol/L KH2PO4和5.6 mmol/L Na2HPO4组成。负载缓冲液（TPBS）为不同摩尔浓度海藻糖溶于100 mOsm PBS (pH 7.2)。
硫酸?蒽酮试剂为98%浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中配制成的80％硫酸溶液。取分析纯蒽酮0.2 g加80%硫酸溶液100 ml，使溶解、摇匀，用前配制。
MultiskanMK3 型酶标仪( Thermo labsystems 公司产品)；NiHon KoHDEN(MEK?6108K型)血细胞自动分析仪购自北京高吉科学仪器有限公司。WDD?1型发光光度计为北京第二光学仪器厂产品。
红细胞的分离
新鲜红细胞 室温（22℃左右）条件下，用ACD三联采血袋3分钟内采集全血200 ml，离心（1 007×g转，10分钟）去除富含血小板血浆（PRP）及白膜层得到压积红细胞。应用等渗300 mOsm PBS (pH 7.2)洗涤3次（1 007×g，10分钟），弃尽上清备用。
4℃保存72小时的红细胞 同一批新鲜红细胞4℃保存72小时，处理同新鲜红细胞。
新鲜红细胞对海藻糖的负载及检测
海藻糖的负载 温度试验中，取压积红细胞重悬于800 mmol/L负载缓冲液中，在不同温度(4、22及37℃)下孵育10小时；时间试验中，37℃在800 mmol/L负载缓冲液中分别孵育0、2、4、6、8、10小时；浓度试验中，37℃条件下，在不同海藻糖浓度（0、200、400、600、800、1 000 mmol/L）负载缓冲液中孵育8小时。所有试验中，红细胞最终压积均为40％。在孵育终点取出适量负载红细胞，以300 mOsm PBS (pH 7.2)洗涤3次（1 007×g，3分钟），弃尽上清后收集红细胞备检测。
胞内海藻糖检测 用硫酸?蒽酮法［2］检测胞内海藻糖，加入3倍体积的0.5 mol/L三氯乙酸提取红细胞胞内海藻糖，4℃放置1小时，离心后重复提取1次，2次提取液混合作为胞内海藻糖待测液。取待测液250 μl，加入1 ml 硫酸蒽酮溶液，冰水浴中摇匀、冷却，沸水精确煮沸10分钟，冰水冷却后置室温10分钟，测定溶液光密度(OD) 。
固定孵育条件对新鲜红细胞和4℃保存72小时的红细胞的影响
取新鲜红细胞和4℃保存72小时的红细胞在相同条件处理得压积红细胞，37℃重悬于不同海藻糖浓度的负载缓冲液（0、200、400、600、800、1 000 mmol/L）中，红细胞最终压积均为40％。同上述操作后进行胞内海藻糖浓度、游离血红蛋白（FHb）、血红蛋白（Hb）和红细胞平均体积（MCV）的测定。
各项物理指标测定
用红细胞计数仪测定MCV、红细胞压积（HCT）、Hb。
游离血红蛋白测定
压积红细胞重悬于负载缓冲液中在一定条件下孵育，孵育结束后经1 007×g离心3分钟，取上清液，用Trinder反应测定FHb浓度。
ATP活性测定
用生物发光法测定负载红细胞内ATP含量［3］。
统计学方法
实验数据用(±SD）表示，用SPSS软件对数据进行配对t检验，在进行分析。
结 果
孵育温度对新鲜红细胞负载海藻糖的影响
在4、22和37℃条件下，孵育10小时过程中新鲜红细胞对海藻糖的负载，结果见图1。由图1可见，当温度为4℃时，红细胞对海藻糖的负载效率很低，当孵育时间达10小时时，胞内海藻糖浓度也仅为1.25 mmol/L左右。而随温度的升高，红细胞对海藻糖的吸收明显增加，当温度为37℃时，10小时末胞内海藻糖浓度可达85 mmol/L。
Figure 1. Effect of incubation time at different temperatures on trehalose loading efficiency.
孵育时间对新鲜红细胞负载海藻糖的影响
37℃条件下，随孵育时间的延长，新鲜红细胞对海藻糖的负载量呈逐步上升趋势。当孵育时间在0-6小时内时，红细胞对海藻糖的摄取效率较低；当超过6小时时，红细胞对海藻糖的摄取量明显增加，但以6-8小时内摄取效率最高（图1）。
胞外海藻糖浓度对新鲜红细胞负载海藻糖的影响
研究发现，当胞外海藻糖浓度不断增加并超过等渗条件时，新鲜红细胞对海藻糖的负载效率也相应增加。针对一系列胞外海藻糖浓度，经37℃条件下孵育8小时，新鲜红细胞对海藻糖的负载效率如图2所示。数据表明，当胞外海藻糖浓度在200-600 mmol/L之间时，红细胞对海藻糖的摄取量很少，当负载缓冲液中海藻糖浓度达800 mmol/L和1 000 mmol/L时，红细胞对海藻糖的负载急剧增加，胞内海藻糖浓度分别达到65和70 mmol/L。
新鲜红细胞在37℃条件下孵育8小时，胞外海藻糖浓度对游离血红蛋白、ATP、MCV的影响
研究表明：新鲜红细胞经37℃条件孵育8小时，负载缓冲液中FHb的变化趋势同红细胞对海藻糖负载的变化趋势基本类似。研究数据表明，当胞外海藻糖浓度在200-600 mmol/L之间时，负载液中游离血红蛋白浓度很低，不超过0.8 g/L；而当负载缓冲液海藻糖浓度达800 mmol/L和 1 000 mmol/L时，负载液中游离血红蛋白浓度大大增加，分别达到6.5和25 g/L，明显高于4℃保存72小时的红细胞（图3）。
由图4可以看出，新鲜红细胞经37℃孵育8小时，当胞外液海藻糖浓度从200增加至1 000 mmol/L，负载红细胞的ATP含量虽然随胞外海藻糖浓度的增加略有下降趋势。1 000 mmol/L负载缓冲液中红细胞的ATP含量同等渗PBS中红细胞的ATP含量相比，并没有明显的下降（P＞0.05）。
Figure 4. Effect of extracellular trehalose on ATP when loading trehalose into RBC at 37℃ for 8 hours. 胞外海藻糖浓度对负载红细胞MCV影的研究表明：随胞外海藻糖浓度的增加，MCV呈先降低再增加的趋势，当胞外海藻糖浓度为800 mmol/L时，MCV降到最低值，当胞外海藻糖浓度继续增加至1 000 mmol/L时，MCV可超过PBS等渗液悬浮红细胞的体积（图5）。
新鲜红细胞和4℃保存72小时红细胞胞内海藻糖浓度、FHb、Hb和MCV的比较
在37℃条件下，新鲜红细胞和4℃保存72小时红细胞在海藻糖浓度为800 mmol/L的负载缓冲液中孵育8小时后，两组红细胞对海藻糖的摄取量基本相同，分别为65.505±6.314和66.2±5.002 mmol/L；但4℃保存72小时红细胞负载液中游离血红蛋白浓度明显高于新鲜红细胞（P＜0.01）；两组红细胞的Hb和MCV没有明显统计学差异（P＞0.05）（附表）。
讨 论
在对红细胞的冰冻干燥保存研究中，研究者们一直无法解决冻干过程中红细胞膜破损、血红蛋白外漏、红细胞携氧功能丧失的难题。在众多可供选择的冻干保护剂中，海藻糖在抗干燥保护方面表现出独特优势，越来越受到研究者的关注。大量实验证明，海藻糖在干燥条件下具有稳定生物膜的作用［4］；在高温潮湿的恶劣环境中，海藻糖比其它糖类能更好地维持细胞稳定性；海藻糖能稳定Hb的高级结构，使其生理功能得到保护。但海藻糖只有进入细胞内部，分布于生物膜的两侧才能发挥保护作用。由于海藻糖不能透过细胞膜，因此如何将海藻糖导入细胞内是对研究细胞和器官低温保存的研究者们的一个巨大挑战。以往研究者利用细胞内吞、生物打孔、电穿孔、基因工程技术、磷脂相转变原理等［5-9］将海藻糖导入哺乳动物细胞内。作为冻干保存人红细胞的第一步，本研究通过对影响海藻糖负载多种因素的研究，根据红细胞海藻糖的负载量和各种理化指标变化的双重衡量，探讨红细胞负载海藻糖的最佳条件。
研究表明，红细胞对海藻糖的负载和孵育温度、时间和负载缓冲液海藻糖浓度密切相关。其中，红细胞对海藻糖的负载明显依赖于胞外海藻糖的浓度。Satpathy［10］认为，海藻糖通过胞内外渗透压差异和膜相变的联合作用进入红细胞内。本实验室使用100 mOsm PBS配制不同浓度的负载缓冲液，既保持溶液的缓冲能力，又尽可能的在相应渗透压范围内提高海藻糖浓度。当胞外海藻糖浓度低于600 mmol/L时，红细胞对海藻糖没有明显的摄取。这说明其摄取机制可能并不是易化扩散，因为易化扩散可以在很低的胞外介质浓度时发生。但当胞外海藻糖浓度大于600 mmol/L时，红细胞对其的摄取量开始增加，似乎又表明海藻糖的跨膜转运能量有部分是来源于细胞内外的渗透压差，增加细胞内外海藻糖的浓度梯度是海藻糖跨膜转运中首先出现的推动力。当负载缓冲液浓度达800 mmol/L和1 000 mmol/L时，红细胞对海藻糖的负载急剧增加，胞内海藻糖浓度分别达到65和70 mmol/L。但这里也要考虑到随海藻糖浓度的增加，高渗透压对红细胞膜的损伤。研究显示，负载缓冲液中游离血红蛋白的变化趋势同红细胞对海藻糖摄取的变化趋势基本类似。研究数据表明，当胞外海藻糖浓度低于600 mmol/L时，负载缓冲液中游离血红蛋白浓度很低，不超过0.8 g/L；当负载液海藻糖浓度达800 mmol/L和1 000 mmol/L时，负载液中游离血红蛋白明显增加，分别达到6.5和25 g/L，说明负载红细胞在1 007×g离心下，有红细胞膜的损伤，血红蛋白外漏。对负载红细胞MCV的测定结果显示，随负载缓冲液海藻糖浓度的升高，红细胞体积逐渐缩小，但当负载缓冲液达到1 000 mmol/L时，孵育终点的红细胞体积却大于等渗PBS中悬浮红细胞体积，这说明在此高渗条件下有可能造成负载红细胞的肿胀损伤。红细胞内ATP含量与红细胞膜的完整性和变形能力密切相关，同时与输注后红细胞24小时的生存率有极为显著的相关性［3］。由图4可见，负载红细胞的ATP含量并不随胞外海藻糖浓度升高而出现明显的下降，1 000 mmol/L负载缓冲液中红细胞的ATP含量同等渗PBS中红细胞的ATP相比，未有显著性差异（P＝0.2054）。高渗环境虽然有可能使红细胞膜破坏，但对红细胞膜结构和功能影响不大。
我们的研究表明，随着温度的上升，红细胞对海藻糖的摄取呈显著上升的趋势，这说明较高的温度可提高红细胞对海藻糖的吸收率。Wolkers等［11］发现，红细胞质膜在14℃时磷脂熔解，造成一个低协同性相变，而另一个相变点在34℃左右，这主要是由于胆固醇和鞘脂类富集区的熔解而引起的。在本研究中,选取4℃、22℃和37℃进行红细胞对海藻糖的负载。结果显示，当孵育温度为37℃时，海藻糖的吸收率显著增高，这表明膜磷脂相变, 尤其是胆固醇和鞘磷脂的变化对糖吸收有较大影响。
孵育时间对红细胞摄取海藻糖也有一定的影响。随孵育时间的延长，红细胞对海藻糖的负载呈逐步上升的趋势，以6-8小时内摄取效率为最高。由于本研究采用温和海藻糖导入方法，需要相对较长的孵育时间（8小时）才能使红细胞胞内海藻糖浓度达到较高浓度。
通过新鲜红细胞和4℃保存72小时红细胞海藻糖摄取量、游离血红蛋白、Hb、MCV的比较发现：在固定孵育条件下，新鲜红细胞和4℃保存72小时红细胞海藻糖摄取量基本相同，但保存的红细胞在高渗环境中更易损伤，溶血率明显增加。这可能是不同中经海藻糖孵育后红细胞有不同溶血率的解释。为达到更好的海藻糖吸收效果，应尽量采用新鲜红细胞进行处理。
综上所述，根据红细胞对海藻糖的成功负载量和各种理化指标变化的双重衡量，确定红细胞负载海藻糖的最佳条件为采用新鲜红细胞，37℃条件下在胞外海藻糖浓度为800 mmol/L的负载缓冲液中孵育8小时。考虑到红细胞对海藻糖吸收效率的提高与细胞损伤存在一定的协同关系，即在糖吸收率提高的情况下,红细胞受的伤害也相应增加，所以优化负载方法，提高海藻糖负载率，降低负载过程中红细胞溶血率，仍是今后进一步研究的内容。
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