小鼠间充质干细胞培养扩增后生物学特性研究
作者：解琳娜, 王健民,邱慧颖, 高磊, 周虹, 龚胜兰
【摘要】 本研究目的是分离富集小鼠骨髓间充质干细胞（mMSC），鉴定其生物学特性和多向分化潜能。取4-5周龄雄性C57BL/6小鼠骨髓细胞，采用全骨髓贴壁法和单克隆培养法分离、纯化和扩增mMSC；分析细胞免疫表型、生长曲线、细胞周期；进行多向分化潜能鉴定；传代培养达30代后，进行成瘤性检测。结果表明：建立的小鼠间充质干细胞系在体外可连续传代培养达30代，细胞仍保持多向分化潜能，细胞高表达CD29、CD44、Sca?1、MHC?Ⅰ，中度表达CD13、CD90.2，不表达CD117、CD45、Flk?1、MHC?Ⅱ类抗原。mMSC体外能诱导分化成骨、脂肪、软骨细胞。结论：全骨髓贴壁法和集落培养法富集可获得mMSC，其在体外连续传代30代以上仍能维持生物学特性稳定，具有高度的增殖和多向分化潜能，无成瘤性。
【关键词】 间充质干细胞 骨髓 细胞培养 生物学特性
Enrichment and Biological Characteristics of Murine Mesenchymal Stem Cells
Abstract The study was aimed to isolate and establish mesenchymal stem cell line from adult murine bone marrow as well as to identify its biological characteristics and differentiation potential. Bone marrow cells (BMCs) were collected by flushing the femurs and tibias of 4?5?week?old male C57BL/6 mice, and were inoculated at a concentration of 1×106/cm2. mMSCs were isolated, enriched and expanded by using bone marrow adherant culture and monoclonal culture. The characteristics of the cells, such as morphology, growth pattern, cell cycle, phenotype, karyotype and multipotent differentiation potential, cytogenetic stability and tumorigenesis were determined. The results indicated that the cell population consisted of spindle? and star?shaped cells, they were highly positive for CD29, CD44, Sca?1, MHC?Ⅰ, moderate positive for CD13, CD90.2 and negative for CD117, CD45, Flk?1 and MHC?Ⅱ. mMSCs could be induced to differentiate into adipocytes, osteoblast cells and chondrocytes. It is concluded that mMSC can be isolted, expanded and enriched by using bone marrow adhcrent culture and monoclonal culture. No tumor formations are observed for 3 months in nude mice after subcutaneous injection. mMSCs retain their properties after at least 30 passages in culture as well as from frozen stocks.
Key words mesenchymal stem cell; bone marrow; cell culeure; biological characteristics
J Exp Hematol 2007; 15(3):542-546
间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）是来源于中胚层的一种成体干细胞，MSC易于富集和扩增，不涉及伦问题，已被越来越广泛地应用到组织工程中,是理想的种子细胞。目前已从大鼠［1］、猫［2］、狗［3］、狒狒［4］、兔［5］、猪［6］、山羊［7］、绵羊［8］等多种哺乳类动物中成功分离MSC。由于小鼠MSC的分离、纯化较其它动物困难，故这方面的报道相对少见。然而，小鼠与人类基因有90%同源性，是非常好的生理和病理的哺乳动物模型，如果能分离、纯化小鼠MSC，并应用到动物模型的研究中，就可以更好地推进MSC的临床研究，为其广泛应用打下基础。故我们进行了小鼠间充质干细胞分离、富集培养，并对其生物学特性进行了分析。
材料和方法
主要材料
DMEM?LG （Gibco 公司产品）； 胎牛血清 （Hyclone公司产品）；小鼠单克隆抗体PE CD13、MHC?Ⅰ（Serotec公司产品）；抗小鼠单克隆抗体PE CD29、CD44、CD90.2、CD117、Sca?1、Flk?1、MHC?Ⅱ、PE/Cy5?CD45（Biolegend公司产品）。L?谷氨酰胺、青链霉素、地塞米松、1?甲基?3?异丁基?黄嘌呤（IBXM）、吲哚美辛、牛胰岛素、β?甘油磷酸钠、维生素（均为Sigma公司产品）。
实验动物
雄性C57BL/6小鼠，3-4周龄，购自第二军医大学实验动物中心。
mMSC的原代培养及传代培养
用颈椎脱臼法处死小鼠，于75%乙醇中浸泡5分钟，无菌条件下冲取小鼠骨髓细胞；用维持培养液（DMEM?LG+10% FBS+4 mmol/L L?谷氨酰胺+100 U/ml青霉素+100 μg/ml链霉素）重悬，按1×106/cm2接种，于37℃、5% CO2、100%饱和湿度的培养箱中培养。于24-36小时后全量换液，每3日换液1次；当贴壁细胞约75%汇合时消化细胞，在96孔板按10个/孔的密度接种原代培养的贴壁细胞（30/cm2），每3天换液1次；消化孔中有克隆长出的细胞，再分别接种6孔板，此时记为P1代，纯化的mMSC细胞维持培养密度为（1.5-3）×103/cm2，细胞汇合率达80%-90％，每36-48 小时需消化传代1次。
细胞生长曲线测定
分别取P5、P10、P15、P30代mMSC，以5 000/well的密度接种于24孔板内，于培养第1天至第8天定时消化3个复孔细胞，计数，绘制细胞生长曲线。
细胞周期分析
分别取生长融合达30%-40％和90%以上的mMSC，以4℃预冷的70%冰乙醇固定，4℃放置24小时；用PBS洗涤2次；加入RNA酶10 μg和碘化丙锭（PI） 0.3 ml重悬细胞（4℃，30分钟）。用流式细胞仪以FL2红色荧光条件检测。应用Modfit LT 2.0软件分析细胞周期。
细胞免疫表型鉴定
收集P5、P10、P15、P30代mMSC，以Trypsin?EDTA消化，取约106细胞，分别加入荧光标记单克隆抗体CD13?PE、CD29?PE、CD44?PE、CD90.2?PE、CD117?PE、Sca?1?PE、Flk?1?PE、MHC?Ⅰ?PE、MHC?Ⅱ?PE、CD45?PE/Cy5，于室温避光孵育30分钟，加入2 ml的PBS，260×g离心5分钟，弃上清，加入300 μl的PBS重悬细胞，设空白/阴性对照，进行流式细胞仪检测，以Cellquest软件采集数据，分析阳性细胞比例。
多向分化潜能鉴定
分别取P5、P15代mMSC，以1×104/cm2的密度接种于6孔板中（内含预处理的小玻片，设实验组与对照组）。
向脂肪细胞诱导 诱导培养条件参见［9］，mMSC培养10-14天。取出细胞爬片，用PBS冲洗，10%甲醛固定10分钟，用PBS洗，油红O染色30分钟，镜下观察。
向成骨细胞诱导 按文献［9］诱导培养mMSC 3周，取出细胞爬片，用PBS冲洗后进行AKP（碱性磷酸酶）检测、Von kossa 染色钙盐沉着鉴定、Ⅰ型胶原的免疫组织化学(中山公司产品)检测等进行成骨细胞鉴定。
向成软骨细胞诱导 mMSC于诱导培养液（10% FBS/DMEM?LG+4 mmol/L L?谷氨酰胺+100 U/ml青霉素+100 μg/ml链霉素+10-8mol/L地塞米松+10 ng/ml hTGF?β1 +50 ng/ml hIGF?1+50 μg/ml维生素C）培养3周，取出细胞爬片进行HE染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学(中山公司产品)检测。
mMSC细胞遗传学分析（染色体G显带）
取对数生长期的P5、P10、P15代mMSC（约2×106个细胞），培养液中加入秋水仙胺（终浓度为0.05 μg/ml），置于37℃温箱中1小时，弃培养液；Trypsin?EDTA消化获得细胞；制备染色体标本［10］。
mMSC成瘤性检测
BALB/C?nu/nu小鼠15只，随机分为3组。接种物无菌接种于小鼠背部脊柱右侧皮下。阴性对照组3只, 接种0.2 ml PBS；阳性对照组6只，接种小鼠纤维肉瘤细胞系MCA207/HER2细胞悬液，密度2.0×106/0.2 ml PBS；实验组6只，接种P15 mMSC细胞悬液，密度5.0×106/0.2 ml PBS。接种后持续观察小鼠的一般状况、体重及接种位点变化；在接种3个月后处死裸鼠，检查接种部位是否成瘤。
结 果
mMSC细胞系的建立
利用mMSC贴壁生长的特点，将全骨髓贴壁法和单克隆培养法相结合，选原代贴壁细胞，以30/cm2的密度种植，细胞生长汇合至70%-80％传代，维持培养密度为（1.5-3）×103/cm2，每48-60小时传代1次。细胞传代至30代以上，生长状态良好，呈纺锤样或星状，核大浆少，1-2个核仁者居多。达100％融合时细胞呈辐射状、漩涡状排列。实验中共获得4个细胞株，对2株进行了诱导鉴定。细胞形态见图1，生长曲线变化见图2。
Figure 1. Morphology of the cells in vitro culture. A:colony of primary culture; B:mMSCs (common light microscope， ×100); C:mMSCs showing a swirl growth; D:mMSCs shown with Wright?Giemsa's staining.
细胞增殖特征
细胞群体倍增时间为30.8±0.96小时。当mMSC达30％-40%或90%以上融合的时，G0/G1期细胞百分比分别为40.62％和82.36％，S/G2/M期细胞百分比分别为59.38％和17.64％（图3）。
体外分化潜能
mMSC细胞系具有向成骨、成脂肪、成软骨细胞分Figure 2. Growth curve of mMSCs. There is no diffe? rence in the different passages.（P＞0.05）
化的潜能。成骨诱导后，偶氮偶联法碱磷酶染色见胞浆有深紫色沉淀，阳性细胞率 91.25±3.15％（图4B）；Von kossa 染色,显示黑褐色钙盐沉积（图4C）；骨Ⅰ型胶原表达，阳性细胞率 89.56±4.55％（图4D）。成脂肪诱导的阳性细胞比例 65.25±4.15%（图4E、F）。成软骨细胞诱导后，细胞体积变大，呈多角形或类圆形，多核或单核，胞浆丰富，Ⅱ型胶原阳性细胞率 62.5±3.5％（图4G、H）。
讨 论
小鼠是研究MSC细胞生物学特征的理想模型。然而，应用标准的黏附分离法获得相对纯化的MSC却很困难,其原因：①MSC数量约2-5个/106骨髓单个核细胞［11］，含量极低；②MSC所处的位置接近于骨内膜和骨密质［12,13］，紧密的骨质使得细胞不易被获取；③造血细胞的干扰,小鼠骨髓黏附细胞中除MSC外，还包含大量造血细胞。造血细胞是通过表面的黏附分子，细胞因子受体和细胞外基质蛋白等的促进作用而直接黏附在培养皿上，且在缺乏外源性生长因子的情况下，基质细胞仍具有支持粒系和B淋巴细胞的功能,故传代后造血细胞仍可混杂在培养体系中；④MSC无独特的免疫表型，而且黏附的MSC在没有分化诱导的培养条件下也可表达分化的表型［14］,免疫分选法可能会造成间充质干细胞损失；⑤小鼠品系的不同,品系的差异对mMSCs的分离、培养也有一定影响。Anjos?Afonso等［15］比较了NOD/SCID、NOD/SCID?β2null、C57BL/6 3种品系小鼠MSC的分离培养。发现NOD/SCID来源的MSC较野生型C57BL/6具有更高的细胞纯化、扩增能力。国内实验中多采用BABL/c来源的MSC［16］,但在培养传代中发现，MSC在传代至第8代后细胞增殖能力明显下降［17］。
大多数研究者为富集mMSC，采用磁珠分选法和生长因子参与培养传代的方法。Tropel等［18］将C57BL/6小鼠全骨髓细胞以2×106/cm2的密度接种，磁珠分选贴壁细胞，获得CD11b-单个核细胞，以1×103 /cm2的密度接种在FN包被的塑料培养皿中，并在培养体系中添加了EGF（表皮生长因子）10 ng/ml和PDGF?AA(血小板源生长因子)10 ng/ml（可以促进全骨髓细胞的CFU?F形成），直到成纤维细胞集落出现。上述方法虽然获得mMSC纯度高，但成本亦高，无法满足大规模动物实验的要求。
为达到简单、低成本获得mMSC的目的，在本实验中我们采用过密度梯度离心法，全骨髓细胞裂解红细胞后直接贴壁法，定期换液去除悬浮生长的造血细胞。获得的贴壁细胞数量均较少，传代后细胞无集落样生长。分析原因：密度梯度离心法造成一定数量单个核细胞损失；裂解红细胞法虽然避免了单个核细胞数量的损失，但影响了干细胞的生长。最终我们采用全骨髓细胞贴壁法，将分离获得的全骨髓细胞悬液，以1×106/cm2较高密度接种，24-36小时首次换液，尔后定期换液去除悬浮生长的细胞，待贴壁细胞集落形成、细胞融合达70%-80％后收集细胞，按每孔10个细胞的密度接种于96孔板（30/cm2），约2％的孔中有集落形成，贴壁细胞约1/5×103。我们将全骨髓贴壁法和集落化培养相结合的方法，达到低成本分离、纯化mMSC的目的。而且，在未添加细胞因子的生长条件下，mMSC的扩增能力未受影响，细胞扩增至30代以上，生物学特征稳定。全骨髓贴壁法培养体系中，造血细胞和非MSC细胞的存在可以为MSC的生长提供适宜的微环境，还可能分泌PDGF、EGF等生长因子促进其早期的集落形成。MSC完成原代集落形成之后，对生长因子的依赖性减低，此时再进行集落的培养，可以获得高富集度的MSC，且细胞扩增能力稳定。
间充质干细胞无特异性表面标志。我们的结果提示，mMSC高表达Sca?1、CD29、CD44、MHC?Ⅰ类分子；中表达CD13、CD90.2（Thy?1.2，在C57BL/6品系小鼠细胞中特异表达）；低表达造血前体细胞标志CD117（c?kit）、CD45（白细胞共同抗原）、Flk?1（血管内皮生长因子受体）、MHC?Ⅱ类分子。与Phinney等［19］等获得FVB/N小鼠的MSC低表达CD11b、CD31、CD34、CD45、CD117等造血系和内皮细胞系表型，表达CD9、CD29、CD44、CD81、CD106和Sca?1等典型标记的结果相符。
干细胞和肿瘤细胞具有高迁徙性、自我更新能力、永生性和异质性等潜能。Masako等［20］将C57BL/6小鼠来源的MSC连续传代1年以上，细胞获得无限繁殖的能力，且传代中积累的染色体结构和数目的缺失等非克隆性异常逐渐演变成克隆性异常，成为恶性细胞群，在体内可以形成纤维肉瘤。为后期应用体内实验做准备，我们对获得的mMSC细胞遗传学性状及潜在成瘤性进行了检测。染色体G显带分析未发现明显染色体异常。mMSC种植于裸鼠皮下3个月后未见肿瘤形成。
综上所述，本实验用直接法简便分离、培养的mMSC在体外传代培养至30代仍保持生物学特性稳定，无致瘤性，可安全应用于体内。这为更好地以小鼠为模型，研究MSC在造血干细胞移植中的作用提供实验依据。
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