供体TReg细胞对小鼠异基因骨髓移植后GVHD和造血重建的影响
作者：杨凯，刘启发，范志平，张钰
【摘要】 本研究探讨供体CD4+CD25+调控T细胞(regulatory T cell, TReg)输注对异基因骨髓移植(allo?BMT)后小鼠移植物抗宿主病(GVHD)和造血重建的影响。建立C57BL/6→BALB/c小鼠allo?BMT模型，体外磁珠分离纯化供鼠外周血CD4+CD25+TReg细胞，接受移植的小鼠随机分为3组，在移植骨髓后6-8小时分别予尾静脉输注CD4+CD25+T细胞、CD4+CD25-T细胞和RPMI 1640培养液（空白对照）。以移植后GVHD表现，肝、脾、小肠组织病理形态、生存期及白细胞(WBC)、血小板(Plt)的重建为观察指标并进行组间比较。结果显示： TReg阳性细胞移植组，TReg阴性细胞移植组和空白对照组小鼠WBC>1.0×109/L的时间分别为(8.14±3.26)天、(17.62±5.71)天、(19.81±6.77)天； Plt>20.0×109/L的时间分别为(5.29±1.34)天、(8.97±3.44)天、(9.52±3.92)天，TReg阳性细胞移植组WBC和Plt恢复时间比TReg阴性组与空白对照组快(P<0.05)。3组小鼠在移植后15天GVHD评分为(1.33±0.58)、(1.80±0.27)、(1.93±0.45)，TReg阳性细胞移植组小鼠与TReg阴性细胞移植组、空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。移植后(25-30天)的TReg阳性细胞移植组小鼠肝、脾、小肠GVHD病理损害较同期TReg阴性细胞移植组与空白对照组小鼠有一定程度的减轻。3组小鼠移植后平均存活时间分别为(41.45±17.88)天、(18.75±14.39)天和(25.67±16.84)天，TReg阳性细胞移植组小鼠平均存活时间较TReg阴性细胞、空白对照组小鼠延长(P<0.05)。结论：小鼠allo?BMT后输注供体TReg细胞可以减轻移植后GVHD程度，延长小鼠生存期，促进造血重建。
【关键词】 异基因骨髓移植 CD4+CD25+调控T细胞 移植物抗宿主病 造血重建
Influence of Donor TReg Cells on GVHD and Hematopoietic Reconstitution after Allogeneic Bone Marrow Transplantation in Mice
Abstract In order to explore the influence of purified donor regulatory T cells (TReg cells) infused after allogeneic bone marrow transplantation (allo?BMT) on GVHD and hematopoietic reconstitution of mice, an allo?BMT model of C57BL/6→BALB/c mice was established . CD4+CD25+TReg cells were purified through bead?magnetic activated cells seperated from donor mice peripheral blood. The recipient mice were randomly divided into three groups: CD4+CD25+ T cells, CD4+CD25- T cells and RPMI 1640 culture medium. These cells and RPMI 1640 were infused into recipient mice by caudal veins at about 6 to 8 hours after allo?BMT respectively. Incidence of GVHD, pathological lesion of liver, spleen, small intestine, survival time and hematopoietic reconstitution in the recipients were observed after allo?BMT. The results showed that the time for WBC>1.0×109/L was (8.14±3.26)days, (17.62±5.71)days, (19.81±6.77)days and the time for Plt>20.0×109/L was (5.29±1.34)days, (8.97±3.44)days, (9.52±3.92)days in TReg positive cell group, TReg negative cell group and the blank control group respectively, and the recovery times of WBC and Plt in TReg positive cell group were faster than that in TReg negative cell group and the blank control group (P<0.05). The scores of GVHD were (1.33±0.58), (1.80±0.27), (1.93±0.45) in three groups of mice at about 15 days after allo?BMT, respectively, the GVHD in TReg positive cell group was slighter than that in TReg negative cell group and the blank control group (P<0.05). It was found that GVHD pathologic manifestations of the liver, spleen and small intestine in TReg positive cell group were slighter in a certain extent than those in other two groups at about (25-30) days after allo?BMT. The mean survival time in three groups was (41.45±17.88)days, (18.75±14.39)days and (25.67±16.84)days after allo?BMT, respectively, which in the TReg positive cell group was significantly longer than that in other two groups (P<0.05). It is concluded that donor? TReg cell infusion can mitigate the GVHD so as to
Key words allo?BMT; regulatory T cell; GVHD; haematopoietic reconstitution
影响异基因造血干细胞移植(allo?HSCT)预后的主要原因之一是移植物抗宿主病(GVHD)，如何从根本上降低移植后GVHD及与GVHD相关的致死性并发症是亟待解决的难题。CD4+CD25+调控T细胞(regulatory T cell, TReg)是一群表型和功能特异的T细胞，在体内能诱导免疫耐受。自身免疫性疾病和肿瘤方面的研究发现TReg细胞对效应性T细胞有强大的抑制作用［1，2］，因此不难理解TReg细胞在以效应性T细胞作用为主的allo?HSCT后GVHD的发生过程中亦有重要作用。我们建立C57BL/6→BALB/c小鼠异基因骨髓移植(allo?BMT)模型，观察移植后输注供鼠TReg细胞对allo?BMT后GVHD和造血重建的影响，目的在于探讨其在allo?HSCT过程中的应用潜能。
材料和方法
实验小鼠
供鼠采用6-8周龄清洁级C57BL/6(H?2b)雄性小鼠；受鼠采用6-8周龄清洁级BALB/c(H?2d)雌性小鼠，供受鼠全部由南方医科大学实验动物中心提供，均为清洁级动物，饲养条件符合SPF标准。
主要试剂及器材
小鼠CD4+CD25+T细胞磁珠分离试剂盒为R&D Systems公司产品，MiniMACS磁座为Miltenyi Biotec公司产品，PE标记抗小鼠CD25及PE/Cy5标记抗小鼠CD4单克隆抗体为Biolegend公司产品，DNA基因组提取试剂盒及DNA Marker购自上海申能博彩公司，ExTaqDNA聚合酶、dNTP为TaKaRa Biotec公司产品，RPMI 1640为Gibco公司产品。
小鼠allo?BMT模型的建立
6-8周龄清洁级BALB/c健康雌性小鼠共48只作为受鼠，体重18-22 g。移植预处理方案：受鼠受X线直线加速器全身照射，总剂量8.0 Gy，剂量率0.5 Gy/min；照射前1天予腹腔注射环磷酰胺(60 mg/kg)。照射后即在空气层流房中无菌饲养。选择C57BL/6雄性小鼠为供鼠，无菌取小鼠股骨和胫骨骨髓，制成骨髓单个核细胞悬液，用RPMI 1640培养液调整细胞数为2×108/ml；同时取供鼠脾脏，制备脾细胞悬液，以RPMI 1640培养液调整细胞数为4×108/ml。接受X线直线加速器照射的BALB/c受鼠于受照后6小时内从尾静脉注入供鼠已调整浓度后的骨髓和脾细胞混和细胞悬液，每只注入0.1 ml，含有1×107个骨髓细胞和2×107个脾细胞，共移植36只小鼠。另外12只小鼠作为单纯照射对照组。
供鼠CD4+CD25+TReg细胞的体外分选
采用小鼠眼眶动脉采血法收集供鼠外周血，淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，将细胞浓度调至1×108/ml。按CD4+CD25+TReg细胞磁珠分离试剂盒说明分离CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25-T细胞，将分选后的细胞用RPMI 1640培养液调整细胞浓度为5×106/ml，用流式细胞仪(FACS Calibur Becton Dickinson产品)分析分离后TReg细胞的纯度。
供鼠CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25－T细胞的输注
36只接受骨髓移植的小鼠分为3组：TReg阳性细胞移植组、TReg阴性细胞移植组和空白对照组。分别于移植后6-8小时内输注0.1 ml纯化后的供鼠CD4+CD25+T细胞(含5×105个细胞)、0.1 ml CD4+CD25-T细胞(含5×105个细胞)和0.1 ml RPMI 1640培养液。
移植后小鼠造血重建的观察
在移植当天、移植后5、10、15、20、25和30天，分别断尾，用微量吸管采集受鼠外周血约0.2 ml肝素抗凝，计数小鼠外周血中的WBC和Plt。外周血WBC>1.0×109/L，Plt>20.0×109/L为造血重建指标。
植活证据测定
选用性染色体作为标志，采用PCR法特异性扩增小鼠Y染色体基因。对骨髓移植后生存时间>15天的所有受鼠，眼眶取血约200 μl，按照3S Spin Genomic DNA Miniprep Kit V3.0基因组提取试剂盒的说明步骤提取外周血细胞基因组DNA。参照GenBank提供的小鼠Y染色体基因序列设计引物，由英骏生物技术有限公司合成PCR引物，引物序列P1：5'?CTAAGCCATGTACCACCT?3'，P2：5'?CTCTCTCTTTATCAATTTTTTCT?3'。以提取的基因组DNA作为模板，用去离子水稀释后分别取10 ng进行PCR扩增，去离子水作阴性对照。50 μl PCR反应体系包括5 μl 10×buffer、4 μl 2.5mmol/L MgCl2、2 μl 2.5 mmol/L dNTP、5 μl 小鼠DNA模板、1 μl Taq酶(5 U/μl)、1 μl P1及P2引物(50 μmol/L)、31 μl ddH2O。PCR反应条件为： 94℃预变性5分钟，然后92℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸1分钟，共进行36个循环，再72℃延伸7分钟。将PCR扩增产物进行琼脂糖(2％)电泳，EB染色，用紫外灯观察分析鉴定，并记录结果及拍照保存。
移植后小鼠GVHD的评估、相关病检查及生存情况观察
按照［3］建立的GVHD评分标准对移植后小鼠GVHD的严重程度进行评估，评分指标包括：体重、姿态、活动能力、毛发、皮肤改变。对存活超过25天的小鼠，于移植后30天或接近30天濒死前取小鼠肝、脾、小肠组织进行病理学检查，观察有无GVHD病理改变。观察移植后小鼠的并发症和死亡情况，统计移植后生存时间。
统计学处理
数据统计分析采用SPSS 13.0统计软件包进行处理。结果用均数±标准差(±SD)或百分率(%)表示，多重比较采用方差分析(F检验)。P<0.05有统计学意义。
结 果
磁珠分离纯化前后CD4+CD25+TReg细胞阳性率
分离前小鼠外周血单个核细胞悬液中CD4+CD25+细胞占(8.90±3.42)%，经过MACS两次分离纯化后CD4+CD25+细胞纯度约为(86.90±5.18)%，分离后剩余细胞悬液中CD4+CD25－细胞纯度(80.26±8.19)%(图1)。
Figure 1. Percentage of CD4+CD25+ and CD4+CD25- T cells after and/or before segregation by MACS.
造血重建
除单纯照射组外，其他3组小鼠均获造血重建。移植后TReg阳性细胞移植组、TReg阴性细胞移植组和空白对照组中WBC>1.0×109/L的时间分别为(8.14±3.26)天、(17.62±5.71)天、(19.81±6.77)天，Plt>20.0×109/L的时间分别为(5.29±1.34)天、(8.97±3.44)天、(9.52±3.92)天。移植后各组小鼠在5天左右WBC、Plt降至最低。TReg阳性细胞移植组WBC抑制最轻，恢复明显加快，与TReg阴性细胞移植组与空白对照组比较有统计学意义(P<0.05)。比较Plt的变化过程也提示TReg阳性细胞移植组抑制轻，恢复快，同TReg阴性细胞移植组与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)(图2、3)。
嵌合情况
对骨髓移植后生存时间>15天的所有受鼠(BALB/c)，用PCR法扩增外周血进行Y染色体检查，全部均检到Y染色体(图4)，提示供鼠(C57BL/6)骨髓细胞在受体体内植入成功。
Figure 4. Amplificated Y chromosome in recipient mice by PCR. M: DNA marker. Lane 1,2: Treg positive cell transplantation group. Lane 3,4: Treg negative cell transplantation group. Lane 5: blank control group. Lane 6: female mouse control group.
移植后小鼠GVHD发生的情况
移植后各组小鼠在10天左右开始出现不同程度进食差、体重减轻、呈弓背体位等GVHD表现，按GVHD评分标准对各组小鼠在15天GVHD评分指数进行比较，TReg阳性组与TReg阴性组及空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。在移植后25-30天各组小鼠肝、脾、小肠常规病理切片显示：TReg阴性细胞移植组与空白对照组肝脏标本可见肝细胞肿大，细胞结构不清，汇管区中央静脉和肝血窦有扩张及淤血，GVHD改变较重的标本肝细胞变性、坏死，肝血窦及汇管区有淋巴细胞浸润；脾脏明显萎缩，脾小梁等正常结构破坏，间有巨噬细胞和淋巴细胞侵润，GVHD较重的标本可见脾细胞变性、坏死；小肠可见小肠绒毛坏死脱落，肠粘膜及粘膜下层明显充血水肿，淋巴细胞浸润，严重者小肠结构破坏。而TReg阳性细胞移植组小鼠肝脏结构基本正常，中央汇管区仅有少量炎性细胞浸润，小肠粘膜下层仅少量炎性细胞浸润(图5)。
移植后小鼠存活情况
单纯照射组、TReg阳性细胞移植组、TReg阴性细胞移植组和空白对照组小鼠平均存活时间分别为(7.15±1.91)天、(41.45±17.88)天、(18.75±14.39)天和(25.67±16.84)天(表2)。单纯照射组于照射后7-10天全部死亡，均死于造血衰竭，死亡率100%。TReg阳性细胞移植组小鼠生存时间与TReg阴性细胞移植组、空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。Table 1. Comparison of GVHD between all groups of mice after bone marrow transplantation
讨 论
最理想预防allo?HSCT后的GVHD和提高移植成功率的出路在于建立供受者之间的移植免疫耐受，使供受者间的免疫功能细胞既不发生互相排斥，又能保持其它正常的免疫功能。建立allo?HSCT后免疫耐受的关键是使供者和受者的免疫细胞将外源细胞识别为自我，不对其发生免疫反应。TReg细胞作为独立的功能性T细胞亚群的存在已成为共识［4，5］，其在人类和鼠类的胸腺、淋巴组织和外周血中约占CD4+T细胞的5%-10%，其免疫学特性主要在于参与抑制自身反应性T细胞的功能，同时参与维持免疫耐受［6］。目前相关研究证实：TReg细胞的分化与成熟依赖胸腺的第三功能，啮齿类动物中，CD4+CD8-?SP胸腺细胞是CD4+CD25+TReg细胞的重要来源和前体细胞［7］；胸腺移植模型中证明了胸腺上皮(thymic epithelium，TE)在TReg细胞分化发育中起到十分重要的作用，移植异种或同种异基因胸腺上皮能够诱导对供体来源性的各种组织的免疫耐受，其主要原因是胸腺上皮可以诱导产生CD4+CD25+TReg细胞。在人、大鼠和小鼠中有大约3%-10%的CD4+CD8-单阳性胸腺细胞共表达(co?expression)CD25表面分子，这些细胞能够阻止包括自身免疫性胃炎、自身免疫性小肠炎和自身免疫性糖尿病等在内的多种自身免疫性疾病的形成和［8-10］。本研究用能诱导免疫耐受的目的细胞：CD4+CD25+TReg细胞，研究其在小鼠allo?BMT中对GVHD和造血重建的影响。结果表明：在移植后6-8小时输注5×105个供者TReg细胞能明显降低移植后GVHD的程度，使小鼠生存时间延长，这一结果与相关报道一致［11］。Hoffmann等［12］发现，从未产生免疫耐受性的C57BL/6(H?2b)小鼠脾脏或骨髓分离的CD4+CD25+TReg细胞，在体外是有效的异基因反应的抑制细胞，体内则可减弱经照射的BALB/C(H?2d)小鼠移植后C57BL/6 CD4+CD25-T细胞所致的致死性aGVHD。Taylor等［11］发现，去除供者淋巴细胞中的TReg细胞或在移植前对受者进行TReg细胞去除都可增强GVHD，而应用分离纯化的供者TReg细胞输注给受者可明显减轻受者的GVHD。
有关TReg细胞与造血重建的关系尚未见详细文献报道。本研究发现，供体TReg细胞输注可促进受体小鼠造血重建，其机理尚不清楚，推测可能与T细胞有关。Monteiro等［13］研究发现，CD4+T细胞对移植后造血重建十分重要，去T细胞移植使造血重建时间延长、甚至排斥，这表明移植后造血重建与CD4+T细胞密切相关。持续接受抗原刺激活化的CD4+T细胞能产生相关造血细胞因子，这对移植后刺激造血重建是必不可少的。TReg细胞是一类具有独立性功能的CD4+T淋巴细胞亚群，这群CD4+CD25+的T细胞是否象活化的CD4+T细胞一样，也具有分泌刺激造血生长的生长因子，尚有待于进一步研究查明。
总之，小鼠allo?BMT后供体TReg细胞输注可以减轻移植后GVHD程度，延长小鼠生存时间，促进移植后造血重建。
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