原花青素对大鼠实验性血栓形成的影响
作者：蒋辛, 赵良中, 张海龙, 张军, 王化洲
【摘要】 本研究旨在探讨原花青素（PC）抗血栓形成的作用及其机制。麻醉动物，然后给颈动脉局部施以20%三氯化铁溶液 20分钟，以造成大鼠颈动脉血栓模型。实验分6组：假血栓（对照）组、血栓模型组、阿斯匹林［10 mg/（kg·d）］组、PC 100 mg/（kg·d）组、PC 200 mg/（kg·d）组及PC 400 mg/（kg·d）组。假血栓（对照）组和血栓模型组用生理盐水灌胃，其它各组分别用阿司匹林和PC低、中、高3个不同剂量悬液灌胃，每日2次，连续4周。观察各组药物对实验性血栓形成的大鼠血浆中的血栓烷（TXB2）和6?酮?前列腺素F1α（6?Keto?PGF1α）及血小板P?选择蛋白（GMP?140））含量的影响。结果发现： ①与假血栓对照组比较，血栓模型组血浆TXB2和血小板P?选择蛋白（GMP?140）含量明显升高，血浆6?Keto?PGF1α含量明显降低，差异非常显著（P＜0.01）；②与血栓模型组比较， 3个PC组和阿司匹林组大鼠血浆TXB2和血小板P?选择蛋白（GMP?140）含量明显降低，差异非常显著（P＜0.01），血浆6?Keto?PGF1α含量明显升高（P＜0.01）；③与阿司匹林组比较，3个PC组血浆TXB2和血小板P?选择蛋白（GMP?140）含量均不同程度降低，而血浆6?Keto?PGF1α含量升高，其中尤以PC 400 mg/（kg·d）组最为显著（P＜0.01）。结论： PC具有明显的抗血栓形成作用，其抗血栓形成的机制与抑制血小板活化、聚集及保护血管内皮细胞密切相关。PC抗血栓形成作用有明显的剂量依赖性。PC 400 mg/（kg·d）组的抗血栓作用优于阿司匹林［10 mg/（kg·d）］组。
【关键词】 原花青素 血栓形成 血小板活化 血栓烷 6?酮?前列腺素F1α 血小板P?选择蛋白
Effects of Procyanidin Oligomers on Experimental Thrombosis in Rats
Abstract The study was aimed to investigate the potential effect of procyanidins (PC) as а antithrombotic agent and its mechanism. 48 male SD rats were randomized into 6 groups, which include 8 rats each. Group A was normal control, group B was model control (no treatment), group C was group treated with aspirin ［10mg/（kg·d）］ , groups D, E and F were treated with low, medial and high dose ［100, 200 and 400 mg/（kg·d）］ of PC respectively. In accordance with Kurz′s protocols, rat′s model of thrombosis of common carotid artery was contructed with FeCl3, but for goup A 0.9% of normal saline was used for 20 minutes. The thromboxane B2 (TXB2), 6?Keto?PGF1α and GMP?140 contents in plasma were measured. The results showed that compared with the normal control group, the contents of TXB2 and GMP?140 in plasma markedly increased in all of PC groups and aspirin group, and the contents of 6?Keto?PGF1α in plasma decreased. Compared with the model group, the contents of TXB2 and GMP?140 in plasma markedly decreased in all of PC groups and aspirin group, and the contents of 6?Keto?PGF1α in plasma increased. Compared with the aspirin group, the contents of TXB2 and GMP?140 in plasma reduced in all of PC groups and the contents of 6?Keto?PGF1α in plasma increased which was obvious in PC 400 mg/（kg·d） group. It is concluded that PC shows obvious anti?thrombosis effect, its mechanism closely correlates with inhibition of platelet activation and aggregation as well as protecting vasoendothelial cells. Antithrombosis of PC shows significant dose?dependence. The effect of the PC 400 mg/（kg·d） surpass the aspirin, but there is no significant difference between the PC 200 mg/（kg·d） and aspirin. This study provides experimental basis for clinical prevention and treatment of thrombosis.
Key words procyanidins；thrombosis； platelet activation； TXB2；6?keto?PGF1α ； GMP?140
原花青素（procyanidins，PC）是植物界中广泛存在的一大类多酚化合物的总称，起初统归于缩合鞣质或黄烷醇类，随着分离鉴定技术的提高和研究的深入，现已成为一大类物质［1-4］，其化学结构式如下［3］：法国教授Jacques Masquelier 于1951年首次发现了PC的抗氧化性能。自上世纪60年代开始，欧洲的医生就知道用葡萄籽的提取物枯草热和过敏症，并获得满意的效果；上世纪80年代初，法国医生用它治疗毛细血管脆化，慢性外周性静脉机能不全和视网膜微血管病等微循环疾病。PC作为一种天然强力抗氧化剂，安全无毒副作用。近年来，对原花青素的研究热点主要集中在抗氧化、抗心肌缺血再灌注损伤、抗高血压及调节血脂等方面［5-9］，而PC抑制血栓形成的研究比较少见［10,11］，其作用机制尚需进一步阐明和验证。
实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(3)原花青素对大鼠实验性血栓形成的影响 材料和方法
材料
原花青素粉剂（批号20040719）天津尖峰集团提供。阿司匹林粉剂（批号20040225）山东新华制药股份有限公司提供。血浆血栓烷（TXB2）放射免疫分析药盒（批号20050101）和血浆6?酮?前列腺素（6?Keto?PG）放射免疫分析药盒（批号20050101）均购置于北京市福瑞生物工程公司。人血浆血小板P?选择蛋白（GMP?140）酶标试剂盒（批号20041210）购置于苏州大学血液研究所。这3种试剂盒均为人鼠通用。
实验分组和给药
48只健康Sprague?Dawley（SD）大鼠，雌雄各半，体重240-300 g，由锦州医学院实验动物中心提供。SD大鼠随机分为6组，假血栓（对照）组、血栓模型组、阿司匹林组、原花青素100 mg/（kg·d） 组、原花青素200 mg/（kg·d） 组和原花青素400 mg/（kg·d） 组，每组8只。原花青素和阿司匹林粉末准确称量后用蒸馏水新鲜配制为悬浊液，按照表1分组与给药。
大鼠急性颈总动脉血栓模型的制备
依照Kurz［13］提供的方法诱导产生急性颈总动脉血栓模型。大鼠按照动物体重，以10%乌拉坦（1 ｇ/㎏）腹腔注射进行全身麻醉。将麻醉后的动物仰位固定，切开颈部皮肤，分离皮下结缔组织，暴露一侧颈总动脉。将吸有20%三氯化铁溶液10 μl的1 cm×1 cm的滤纸小片包裹在此段颈总动脉上，计时20分钟取下。假血栓组(正常对照）除不滴加三氯化铁溶液，而应用生理盐水代替外，其余手术步骤同模型组。
大鼠血浆指标检测
末次给药后半小时，在麻醉下，暴露另一侧颈总动脉，用注射器抽取大鼠血液约6 ml，严格按照试剂盒说明书操作并检测各项指标，包括： TXB2、 6?Keto?PGF1α、血小板P?选择蛋白（GMP?140）。
统计学分析
在Windows XP操作环境下，用SPSS 11.0统计软件进行分析与检验。各组实验值以均数±标准差（±SD）表示，数据应用t检验。其他组间比较采用单因素方差分析（F检验）及LSD?t检验。P＜0.05被认为有显著性差异，P＜0.01被认为有非常显著性差异。
结 果
大鼠血浆血栓烷B2（TXB2）和血浆6?Keto?PGF1α含量的测定
血浆血栓烷和血浆6?Keto?PGF1α含量测定结果见表2和图1。 由表2和图1可以看出，与假血栓（正常对照）组相比较，血栓模型组血浆中TXB2含量明显升高，有非常显著差异 （P＜0.01）；与模型组比较，PC 200 mg/（kg·d）、PC 400 mg/（kg·d）组及阿司匹林组［10 mg/（kg·d）］血浆中TXB2含量明显降低，有非常显著差异（P＜0.01）；与阿司匹林组［10 mg/（kg·d）］比较，PC 400组血浆中TXB2含量未见显著差异（P＞0.05）。正常大鼠颈总动脉血浆6?Keto?PGF1α含量保持较低水平。与假血栓组比较，血栓模型组血浆6?Keto?PGF1α含量明显下降，具有非常显著差异（P＜0.01）；与血栓模型组相比，PC 200 mg/（kg·d）组和PC 400 mg/（kg·d）组血浆6?Keto?PGF1α含量明显升高，差异具有显著性（P＜0.01）。与阿司匹林组［10 mg/（kg·d）］相比，PC 200 mg/（kg·d）组和PC 400 mg/（kg·d）组血浆6?Keto?PGF1α含量明显升高，差异具有显著性（P＜0.01），并呈剂量依赖性。
大鼠颈总动脉血浆血小板P?选择蛋白（GMP?140）含量的测定
血浆血小板P?选择蛋白（GMP?140）含量测定结果见表3和图2。 由表3和图2可以看出，正常大鼠颈总动脉血浆血小板P?选择蛋白含量保持极低水平。与假血栓组比较，血栓模型组结果显示血浆血小板P?选择蛋白含量显著上升（P＜0.01），说明血栓造成可溶性血小板P?选择蛋白大量释放。经PC处理后，3组大鼠的血浆血小板P?选择蛋白含量与血栓模型组相比显著下降（P＜0.01） ，并且呈剂量依赖性，随着处理剂量的增加，血小板P?选择蛋白含量下降得越来越明显。阿司匹林处理之后，大鼠血浆血小板P?选择蛋白含量与血栓模型组相比显著下降（P＜0.01），下降幅度介于PC 100 mg/（kg·d）、PC 200 mg/（kg·d）组之间，说明在此项指标中，阿司匹林（10 mg/（kg·d））组的效果不如PC 400 mg/（kg·d）组的效果好。
讨 论
在生理状态下，血液中的凝血系统和抗凝血系统（纤维蛋白溶解系统）处于动态平衡。在某些能促凝血因素作用下，上述动态平衡被打破，触发了凝血过程，血液便可在心血管腔内凝固，形成血栓［14］。血小板的生理功能主要是参与止血与血栓形成。在动脉血栓形成中，血小板的作用是最重要的［15］。
在正常生理状态下，血浆或组织中的TXA2和 PGI2处于相对平衡，保持机体内环境的稳定。因TXA2和PGI2的生物半衰期极短，目前难以直接测定，但可通过测定其稳定的代谢产物TXB2和6?Keto?PGF1α来反映其含量。本实验中，原花青素处理之后，血浆TXB2含量与血栓模型组相比明显降低，并且呈剂量依赖性，随着处理剂量的增加，TXB2含量下降得越明显。这说明原花青素能够抗血小板聚集。原花青素处理组血浆6?Keto?PGF1α含量与血栓模型组相比明显升高，差异具有显著性（P＜0.01），并且呈剂量依赖性，随着处理剂量的增加，6?Keto?PGF1α含量增加得越明显。而阿司匹林不能使实验大鼠血浆6?Keto?PGF1α含量增加。
血小板P?选择蛋白（GMP?140）是近年来发现的血小板活化的特异分子标志，其特异性及敏感性较其它标志蛋白为佳。正常情况下，血小板内含有的颗粒主要有3类：α?颗粒、致密体和溶酶体。随颗粒内容物的释放，颗粒膜蛋白要整合到活化的血小板质膜内，成为血小板活化的标志，并参与止血、炎症、免疫等反应。血小板P?选择蛋白（GMP?140）为α?颗粒膜蛋白（GMP）的一种，当血小板受刺激活化时随α?颗粒内容物的释放并与质膜融合，能持久存在于活化血小板质膜表面，为血小板活化释放的特异标志之一。正常情况下，由于机体内环境相对稳定，体内血浆血小板P?选择蛋白（GMP?140）水平极低。只有当血小板活化后，一方面其伪足形成和断裂后释放凝血因子进入血浆；另一方面其变形能力下降又加速了血小板的活化和破裂，因此血小板P?选择蛋白（GMP?140）水平的变化实质上直接反映了血小板的活化程度。从我们的实验可以看到，PC处理之后，PC 3个组的血浆血小板P?选择蛋白（GMP?140）含量与血栓模型组相比呈现下降趋势，并且呈剂量依赖性，表明PC的抗血小板凝集的效果显著，PC 400 mg/（kg·d）组能将大鼠血浆血小板P?选择蛋白（GMP?140）含量控制到假血栓（正常对照）组的水平。
阿司匹林是目前世界上应用最多的抗血小板聚集药物，它可抑制血小板聚集的第二阶段［15］，其抗血小板作用明确。本研究结果表明， PC 400 mg/（kg·d）组抗血栓作用优于阿司匹林组。原花青素可在胃肠道迅速吸收，45分钟即达峰值，半衰期5小时，14%的药物在11小时内经胆汁排泄。其代谢存在于重要的肠?肝循环。原花青素在血液、肝、肾中为非特异性结合；在皮肤、血管壁、胃肠粘膜中为特异性结合。据推测这与原花青素的血管保护作用有关。大鼠口服单次量50 mg/kg，70%的药物24小时后被排泄，其中6%以二氧化碳形式呼出，19%经尿排泄，45%经粪便排泄［16］。有实验表明，大鼠和小鼠口服原花青素的LD50 均在4 000 mg/kg 以上，大鼠口服60 mg/（kg·d），6个月，狗口服相同剂量12个月均无任何副作用且耐受良好，无致畸、致突变作用；在生殖方面，服用原花青素的雌性动物在生育前后均十分安全［17］。
省学者［7］应用PC对大鼠和人血小板凝聚作用进行的研究结果，提示PC抑制血小板凝聚的机理是抑制凝血氧烷的生物合成，这与本实验结果吻合。本研究发现，原花青素在大鼠体内不仅具有明确的抗血小板聚集作用，明显降低血浆TXB2和血小板P?选择蛋白（GMP?140）水平，还具有促进血管内皮细胞合成与释放PGI2的作用，且成剂量依赖关系。
综上所述，原花青素的抗血栓作用明确，与阿司匹林相比具有一定的优势。资料表明，PC还具有清除氧自由基，抗氧化、抗心肌缺血再灌注损伤［18-21］、抗高血压及调节血脂［22-26］等多种药理作用，因此其抗血小板聚集的机制可能还与上述药理作用密切相关。
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