抗CD28抗体协同刺激增强抗CD3抗体体外激活T淋巴细胞并降低TGF-β的表达
作者：骆群，吕明，于鸣，黎燕
【摘要】 为了探讨体外激活T淋巴细胞的方法及活化后T淋巴细胞的免疫学特征，利用抗CD3、抗CD28抗体在体外刺激健康人外周血单个核细胞PBMNC，检测淋巴细胞转化，CD8+CD25+细胞比例和肿瘤生长因子β（TGF-β）表达等相关免疫学指标。结果表明，在抗CD28抗体的协同作用下，抗CD3抗体的刺激活性明显提高，CD8+CD25+细胞比例明显增加，TGF-β的表达下调。结论： 抗CD28抗体协同刺激可以提供第二信号，使T淋巴细胞充分活化，TGF-β表达水平明显下降
【关键词】 抗CD3抗体
Anti-CD28 Antibody Costimulation Enhances Anti-CD3 antibod Activating T Cells and Lowering TGF-β Expression in Vitro
Abstract In order to study how to activate T cells and their immunological characteristics，the anti-CD3 and anti-CD28 McAbs were used to stimulate PBMNC，then their related immunological changes，such as lymphocyte transformation function，the percentage of CD8+CD25+ cells and TGF-β expression were delected by lymplocyte transformation assay，flow cytometry and RT- PCR respectively. The results showed that in costimulation with anti-CD28 antibody stimulathetion，the activity of anti-CD3 antibody was significantly enchanced，the ratio of CD8+CD25+ cells of T cells was obviously increared，while TGF-β expression was down-regulated. It was concluded that the anti-CD28 antibody costimulation could provide stimulatory signal Ⅱ，which make T cells more active，while the expression of TGF-β significantly down-regulated.
Key words anti-CD3 antibody; anti-CD28 antibody;TGF-β;T cell
T淋巴细胞在人体免疫系统中扮演重要的角色，其在体内处于抑制或耐受状态会导致免疫力下降，从而引起感染与肿瘤等发生。近年来人们一直探讨体将外诱导活化的T淋巴细胞用于过继免疫。T细胞活化需要TCR/CD3识别APC表面的MHC-肽复合物提供的第一信号以及CD28/B7、LFA-1/ICAM-1等协同刺激分子相互作用提供的第二信号。目前国内外多用抗CD3抗体体外激活T细胞，将CD8+CD25+杀伤性T淋巴细胞回输治疗免疫力下降引起的感染与肿瘤［1，2］。但是研究表明，T淋巴细胞在接受第一信号之后，如果不能接受第二信号的刺激，则将迅速呈低反应性或失能。在抗CD3抗体体外激活T淋巴细胞的同时，提供第二信号对T淋巴细胞的活化以及后续的体内回输治疗具有重要意义。T淋巴细胞表面的协同刺激分子CD28与其配体B7的相互作用是为T淋巴细胞活化提供第二信号的主要途径之一，近年来已有报道利用抗CD28抗体协同抗CD3抗体体外扩增活化T淋巴细胞［3，4］。
抗CD3抗体刺激T淋巴细胞后，会介导T淋巴细胞分泌TGF-β。近年来研究提示，TGF-β在介导体内长期免疫耐受的过程中起着关键性作用［5，6］。作为一个有效的免疫抑制因子，TGF-β可使肿瘤细胞逃避宿主的免疫监视，成为肿瘤的一道屏障，这可能是过继性免疫治疗肿瘤后易复发的一个重要原因［7-9］。
本研究在抗CD3抗体体外模拟T淋巴细胞活化的第一信号的同时，利用抗CD28抗体模拟第二信号协同激活T淋巴细胞，增强了抗CD3抗体体外活化T淋巴细胞的功能；与此同时，研究发现在抗CD28抗体协同刺激下TGF-β的表达水平出现明显地下降。
材料和方法
材料
人外周血取自体检合格的献血者。人淋巴细胞分离液（比重1.077±0.002）购自Amersham Bioxciences公司。抗CD3单克隆抗体、抗CD28单克隆抗体由军事医学院基础医学研究所分子免疫室提供。FITC标记的抗CD8、PE标记的抗CD25抗体购自Becton Dickinson公司。3H-TdR购自原子能研究所。RPMI 1640培养液购自Gibco公司。TGF-β ELISA检测试剂盒购自Becton Dickinson公司，TrizoL购自Invitrigen公司。
方法
PBMNC分离
取正常人外周血，用肝素钠抗凝，生理盐水2倍稀释后小心加入等体积的淋巴细胞分离液（ρ=1.077g/mL），2 500×g离心20分钟，取中间单个核细胞层，生理盐水洗2遍，用含10% FCS的RPMI 1640培养液制备成浓度为1×106/ml的单个核细胞悬液备用。
淋巴细胞转化试验
分离人外周血单个核细胞（PBMNC），调整细胞密度为1×109/L，加入96孔板，100 μl/wall。加入相应浓度的CD3抗体（2 μg/ml）、CD28抗体（5 μg/ml），设三个复孔，并设PBS阴性对照孔，于5% CO2、37℃培养56小时。加3H-TdR（1 mCi/ml ）0.5 μCi/wall，继续培养16小时。收集细胞并于液体闪烁仪上计数cpm值。刺激指数（SI）= （实验组cpm值-本底值）/（阴性对照组cpm值-本底值）。
细胞亚群的FACS分析
收集PBMNC，用含2% FCS、0.2 g/L叠氮钠的10 mmol/L PBS洗3次；加入相应抗体，以PBS为阴性对照，冰浴振荡30分钟； 3 400×g离心30秒，收集细胞，将细胞洗3遍后用10 g/L的多聚甲醛固定。用FACS Calibur流式细胞仪检测分析。
RNA的提取
收集PBMNC，PBS洗涤记数。按1×106/ml浓度细胞加入TrizoL ，剧烈震荡裂解细胞。室温静置5分钟后，每1ml TrizoL 加入0.2 ml氯仿，剧烈震荡15秒，室温静置10分钟。将Eppendorf管置于高速台式冷冻离心机，4℃，13 400×g离心15分钟。小心吸取上层液相置于另一无菌Eppendorf 管中，加入等体积异丙醇，室温沉淀10分钟。4℃，13 400×g离心10分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗涤1遍，沉淀的RNA在室温干燥。用30 μl无RNA酶的DEPC水重悬干燥后的RNA。电泳分析以及分光光度计定量，用于下一步实验或-70℃长期保存。
cDNA逆转录
取约含1 μg稀释的RNA溶液，加入Oligo(dT) 1 μl，70℃孵育5分钟，迅速放入冰中冷却，依次按说明书加入2.5 mmol/L dNTP、5×反转录缓冲液、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂，DEPC水。将上述反应物混匀后，42℃反应60分钟，95℃ 5分钟灭活反转录酶，获得的cDNA置-20℃保存备用。
TGF-β表达水平的半定量PCR测定
利用Biosun核酸分析软件，分析TGF-β基因的全序列，获得特异性的区间，设计特异性的引物。取等量的各组cDNA为模板，以GAPDH做为内参照，用半定量的方法测定TGF-β的表达水平。PCR条件如下：94℃预变性5分钟后；开始下列循环：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，扩增30个循环；最后72℃延伸7分钟。2%琼脂凝胶电泳分析，利用Labworks软件对PCR结果条带进行灰度分析，以内参照GAPDH为对照，计算不同抗体条件刺激下的TGF-β的表达情况。
细胞培养上清中TGF-β水平的ELISA分析
按说明书的操作步骤，将TGF-β抗体溶解于包被液（碳酸盐缓冲液pH 9.6），浓度为4 μg/ml，100 μl/wall包被ELISA 96孔板，4℃过夜后，用10 g/L的BSA 37℃封闭2小时，用PBST（PBS+0.1%吐温20）洗涤3遍；按100μl/wall加入各条件刺激下的PBMNC细胞培养上清，37℃孵育1小时，用PBST洗涤3遍；按100μl/wall加入biotin-抗TGF-β抗体，37℃孵育1小时，PBST洗涤3遍；avidin-辣根过氧化酶(a-HRP)50μl/wall，室温放置45分钟，PBST洗涤5遍。OPD显色，于492 nm处测吸收值；以标准的TGF-β做标准曲线，计算各培养上清中TGF-β含量。
统计学处理
应用SPSS软件分析结果，数据用均数±标准差（x±SD）表示，组间比较采用配对t检验，P<0.05为有统计学差异。
结果
抗CD28抗体协同抗CD3抗体激活T淋巴细胞
3H-TdR 掺入实验结果显示，抗CD3抗体在体外可以激活T淋巴细胞，其刺激指数为16.1。单独的抗CD28抗体没有明显的刺激活性；但是在抗CD28抗体的协同作用下，抗CD3抗体的刺激活性明显提高，其刺激指数达到25.9（表1）。Table 1. Enhancing effect of anti-CD3/28 on lymphocyte transformation activity (SI) (略)
抗CD28抗体协同抗CD3抗体增强淋巴细胞转化活性
在实验浓度的抗体刺激后，收集细胞，分析激活后的细胞中CD8+CD25+细胞亚群的变化。结果显示，抗CD3抗体刺激后的细胞中CD8+CD25+细胞由PBS对照组的3.98±0.23%增加到12.3±2.36%；而单纯的抗CD28抗体却没有明显的淋巴细胞转化功能（4.03±0.95%）；但是，在抗CD28抗体协同刺激作用下，抗CD3抗体的淋巴细胞转化功能显著提高，协同刺激后CD8+CD25+细胞所占的比例增高至19.3±1.23%。在抗CD28抗体协同刺激下，抗CD3抗体激活淋巴细胞以及促淋巴细胞转化的功能显著提高（表2，图1）。Table 2. Percentage of CD8+CD25+ cells in total transformed cells by flow-cytometry (略)
TGF-β表达水平的半定量PCR测定结果
利用biosun核酸分析软件分析TGF-β基因全序列，获得特异性的区间，设计特异性的引物，上游引物为：5′-GTTCAAGCAGAGTACACACAGCATATAT ATGTTCT′-3；下游引物为5′-GGAGGGGAAATTG AGGGCTTTCGCCTTAGCGC′-3；扩增区间为TGF-β基因738-1031片段，长为293 bp，可以在凝胶电泳上与内参照 GAPDH 扩增产物 350 bp 的条带明显区分，可用于下一步的半定量实验。收集各条件刺激后的PBMNC，提取总RNA后，在基因水平上利用RT-PCR的方法分析TGF-β的表达水平，以TGF-β条带灰度/GAPDH条带灰度作为分析指标。结果显示，CD3抗体刺激后TGF-β的表达水平明显上升，由PBS对照组的0.036±0.005上升至0.195±0.054。CD28抗体协同作用后，TGF-β的表达水平下降至0.135±0.031（表3，图2）。Table 3. Ratio of TGF-β and GAPDH (略)
细胞培养上清中TGF-β 水平的ELISA分析结果
TGF-β在免疫调节过程中具有重要意义，通过半定量RT-PCR的方法测定其在基因水平的表达情况后，通过ELISA的方法分析其在蛋白水平表达情况。结果与半定量RT-PCR结果一致，CD3抗体刺激后，TGF-β的表达水平与PBS组相比明显上升。而CD3抗体与CD28抗体协同作用后，TGF-β的表达水平明显下降（图3）。
讨论
T细胞在机体免疫系统中起着关键作用，它不仅有直接的免疫效应功能，同时通过产生多种细胞因子及表达黏附分子与其他免疫细胞的直接或者间接接触，发挥广泛的免疫调节作用。正因为如此，T细胞与临床上许多疾病的发生有着直接的或间接的关系，因此它在免疫相关疾病的诊断、预防和方面的应用倍受重视。研究显示，感染及肿瘤的发病与机体T细胞的功能低下或者耐受有着密切的关系。近年来人们一直探讨将体外诱导活化的T淋巴细胞用于过继免疫治疗。国内外已有报道，利用体外容易得到的人PBMNC，通过抗CD3抗体体外扩增活化T淋巴细胞，将激活表型为CD8+CD25+的杀伤细胞回输治疗免疫力下降引起的感染与肿瘤［1，2］。
抗CD3抗体可特异地识别T细胞表面的CD3分子，并通过激活T细胞表面TCR-CD3复合物与APC表面MHC-Ⅱ类分子-抗原肽的结合，使T细胞活化并增殖。但是T淋巴细胞在其全面活化过程中不仅需要T淋巴细胞受体（TCR）/CD3复合物的第一信号，还需要第二信号来增强T淋巴细胞的活化与增殖。一般认为，T淋巴细胞在接受第一信号之后，如果不能接受第二信号的刺激，则其在活化后处于低反应性或失能状态，很快便进入了凋亡。临床实验也证实，抗CD3抗体活化后的T淋巴细胞回输后，很快进入凋亡状态。T淋巴细胞表面的协同刺激分子CD28与其配体B7的相互作用是为T淋巴细胞活化提供第二信号的主要途径之一。如果可以在体外利用抗CD3抗体刺激提供第一信号的同时，用抗CD28抗体协同刺激提供第二信号，就可以使T淋巴细胞充分活化。
本研究利用抗 CD28 抗体模拟第二信号协同抗 CD3 抗体在体外对外周血淋巴细胞进行活化扩增。用3H-TdR掺入法测定抗体，结果表明，单独的抗CD28抗体对PBMNC没有明显的激活活性，但是在抗CD28抗体的协同作用下，抗CD3抗体的激活活性明显提高，其激活指数由16.1提高至25.9。同时，流式细胞仪检测结果显示，在抗CD28抗体的协同刺激下，抗CD3抗体使淋巴细胞的转化功能得到了显著提高，CD8+CD25+细胞所占的比例由12.3±2.36%增高至19.3±1.23%。
抗CD3抗体刺激T淋巴细胞后，会介导T淋巴细胞分泌TGF-β。近年来研究提示，TGF-β在介导体内长期免疫耐受的过程中起着关键作用［5，6］。作为一个有效的免疫抑制因子，TGF-β可使肿瘤细胞逃避宿主的免疫监视，成为肿瘤的一道屏障，这可能是过继性免疫治疗肿瘤后易复发的一个重要原因［7-9］。本研究中，利用半定量RT-PCR的方法以及ELISA方法分别从基因和蛋白水平对各种刺激条件后TGF-β的表达水平进行了测定，CD3抗体刺激后，TGF-β的表达水平明显上升；但是在抗CD28抗体协同作用后，TGF-β的表达水平明显下降。近年来的研究提示，TGF-β可以协同CD4+CD25+等Treg细胞介导免疫耐受，它的分泌可能与这些细胞相关［10-12］，而CD8+CD25+细胞可能会抑制CD4+细胞的活性［13］。本实验中抗CD28抗体协同刺激后TGF-β的表达下调可能与CD8+CD25+细胞相关。
本研究通过体外实验证明，抗CD28抗体的应用可以提供T细胞充分活化所必需的第二信号作用，协同抗CD3抗体激活T淋巴细胞，同时降低抗CD3抗体刺激后TGF-β的表达水平。本实验建立了体外活化T淋巴细胞的扩增方法，为研究T淋巴细胞免疫应答机理建立了细胞模型。
【】
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