间期双色双融合荧光原位杂交监测慢性髓系白血病异基因造血干细胞移植后bcr/abl融合基因
作者：钱思轩，李建勇，张闰，洪鸣，仇海荣，李丽，徐卫，盛瑞兰，吴汉新
【摘要】 本研究探讨bcr/abl双色双融合荧光原位杂交（DD-FISH）的敏感性及临床应用价值。对19例慢性髓细胞白血病（CML）异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后微小残留病灶（MRD）用DD-FISH进行监测，同时与常规细胞遗传学（CC）、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)结果相比较。样本取自骨髓，少数来源于骨髓片或外周血。结果表明：14例CML患者在Allo-HSCT后CC显示持续正常供者核型，RT-PCR转为阴性，移植2月后均为完全供者嵌合（DC），DD-FISH检测结果持续为阴性，平均随访11.25月，MRD无增加。1例CC及RT-PCR阴性，而性染色体FISH为混合嵌合，DD-FISH阳性，监测无MRD增加，临床未，疾病稳定。3例骨髓复发患者的DD-FISH及性染色体FISH均提示MRD明显增加，RT-PCR转为阳性，却只有1例CC异常，供者淋巴细胞输注（DLI）及甲磺酸伊马替尼治疗后均为DC，DD-FISH阴性，RT-PCR阴性。1例骨活检证实髓外复发患者骨髓或外周血样本的DD-FISH、CC及PCR均阴性，供受者完全嵌合。结论：间期双色双融合FISH可应用于CML异基因造血干细胞移植后MRD的监测，其操作简易快速，灵敏度高，且骨髓或外周血均可采用。动态监测能及时发现扩大的白血病细胞克隆。
【关键词】 荧光原位杂交
Monitoring of bcr/abl Fusion Gene by Interphase-Dual-Color and Dual-Fusion Fluorescence in situ Hybridization in CML after Allo-HSCT
Abstract This study was aimed to investigate the sensitivity and clinical application value of interphase-dual-color and dual-fusion fluorescence in situ hybridization (DD-FISH). The minimal residual disease (MRD) in 19 patients with chronic myelogenous leukemia (CML) after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) was detected by DD-FISH，and the detected results were compared with those of conventional cytogenetics (CC) and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).The samples were collected from bone marrow or peripheral blood or smears of bone marrow. The results indicated that 14 out of 19 patients achieved and maintained continuous complete molecular remission after transplantation. In these patients，CC assay displayed normal donor karyotype，result of RT-PCR was negative，complete donor chimerism was detected after 2 months of transplantation，result of DD-FISH was negative，average time of the follow-up survey was 11.25 months，MRD did not increase. Results of CC and RT-PCR in 1 patient showed negative，while FISH of sex chromosome showed mixed chimerism，result of DD-FISH was positive，MRD did not increase，no therapy was given for this patiant，clinical state of patient was stable. Three patients with hematological relapse demonstrated obvious increase of MRD detected by DD-FISH and sex FISH，result of RT-PCR was found positive in them，but the abnormal result of CC was observed only in 1 patient. After donor lymphocyte infusion and imatinib mesylate treatment，these 3 patients achieved cytogenetic remission again，results of DD-FISH，CC and PCR were negative in them. DD-FISH，CC and PCR in bone marrow and peripheral blood from one patient with extramedullary relapse revealed negative results，and the complete chimerism was found in this patient. It is concluded that interphase-dual-color and dual-fusion fluores- cence in situ hybridization is a more reliably sensitive and practicable method for monitoring MRD in patients with CMLafter allo-HSCT，and can be used in detection of chromosome sample and blood or bone marrow smears. Dynamic detection of bcr/abl fusion gene level by FISH may predict disease changes and guide individual therapy.
Key words FISH; DD-FISH，CML，allo-HSCT; bcr/abl fusion gene; MRD
异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是目前治愈慢性髓细胞白血病（CML）的有效方法，Ph染色体和bcr/abl融合基因是CML的特征性标志，应用常规细胞遗传学（CC）及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Ph染色体和bcr/abl融合基因已成为临床确诊CML的重要依据。allo-HSCT后的有效监测关系到能否早期、准确判断肿瘤负荷并及时给予相应治疗。近年来荧光原位杂交（FISH）技术因其简便、快速及灵敏等优势逐渐引起人们的重视。我们采用双色双融合荧光原位杂交（dual-color and dual-fusion FISH，DD-FISH）动态检测19例CML移植后的bcr/abl变化，同时与移植后嵌合状态、CC和RT-PCR的检测结果进行比较。
材料和方法
病例
19例CML系我院2002年6月-2005年5月就诊并接受allo-HSCT的患者，CML的诊断及分期标准参照张之南等主编的《血液病诊断及疗效标准》（第二版）。男9例，女10例，年龄16-58岁（中位年龄39岁），慢性期14例，加速期1例，急变期4例，其中3例转变为急性粒细胞白血病，1例转变为急性淋巴细胞白血病。
移植时期及方式
15例CML患者在确诊后1年内进行allo-HSCT，2例分别在确诊后18月、28月进行移植，2例CML的病程超过5年。3例转变为急性粒细胞白血病患者于allo-HSCT前服用甲磺酸伊马替尼（格列卫）600 mg/day 1-2月。HLA全相合移植13例，其中2例为非亲缘性；HLA半相合移植6例。外周血移植13例，骨髓+外周血混合移植2例，骨髓移植2例，非清髓移植为2例。供受者性别相同者10例，性别不同者9例。19例患者输入供者单个核细胞平均5.68×108/kg，CD34阳性细胞平均为 4.96×106/kg。
预处理方案
半相合移植预处理方案为阿糖胞苷+环磷酰胺（CTX）+全身照射（TBI）；全相合移植为CTX+TBI；非清髓移植则为福达华+TBI。移植后每1-3月进行骨髓常规检查、常规细胞遗传学检测、性染色体分析（供受者性别不同者）、短片段串联重复（short tandem repeats，STR）分析（性别相同者）及RT-PCR和FISH检测bcr/abl融合基因。
染色体核型分析
所有的骨髓细胞进行直接法及短期培养法制备染色体标本，采用R显带技术进行核型分析。核型异常按《国际细胞遗传学命名标准（ISCN 1995）》进行核型分析。
性染色体双色间期FISH检测
X、Y染色体着丝粒特异性DNA探针及方法见［1］。每份间期核标本计数1 000个细胞，并记录杂交信号。绿色荧光信号（G）为X，橘红色荧光信号（O）为Y，根据患者核型为XX或XY的细胞百分率大于对照组的(X埂?SD），即确定有无供体源的植入克隆或患者的残存克隆。
双色双融合间期FISH检测
探针购自美国Vysis公司，BCR探针用SpectrumGreen荧光素标记，ABL探针用Spectrum Orange荧光素标记。具体方法见文献［2］。每份间期核标本计数500-1 000个细胞，并记录杂交信号。正常间期核细胞（G1）期将显示2O2G随机分散的4个杂交信号。2个绿色信号（G）为22号染色体的bcr基因所发出的荧光。2个橘红色信号（O）为9号染色体的abl基因所发出的荧光。阳性细胞：间期核细胞将显示1O1G2F杂交信号。1G为未发生易位的22号染色体上的bcr基因发出的荧光；1O为未发生易位的9号染色体上的abl基因发出的荧光；1个红绿融合信号（F）为融合基因所发出的荧光，叠加为黄色。
RT-PCR 检测
分离单个核细胞，提取总RNA，进行cDNA合成及PCR扩增，PCR引物序列为bcr引物5′ -CTCCAGA CTGTCCACAGCATTCCG-3′，abl引物3′ -AGACT GAAACTCGGAGTCCCAGAC -5′ 。β2-MG 上游引物：5′ -ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3′，下游引物：5′ -ATCTTCAAACCTCCATGATG-3′ 。根据bcr/abl不同的拼接方式，可产生168 bp和93 bp两种扩增带。然后进行PCR，6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察结果。
STR-PCR
裂解红细胞和分离白细胞，将Chalex 100反应液及蛋白酶K与白细胞悬浮液混匀，制成DNA悬液。引物共18对5′ →3′ 和3′ →5′ 引物，分别为 D12S391、D21S11、D6S477、D7S820、D8S384、D8S1545、FGA、D1S549、D8S1179、D3S1754、D12S375、CSFIPO、TH01、D16S539、VWA、D5S818、D18S535和D3S1358，进行PCR。35个热循环周期。PAGE电泳读出条带。
结果
19例患者移植前细胞染色体核型、DD-FISH及RT-PCR均一致反映bcr/abl的存在。17例清髓性移植后平均14天（10-21天）造血重建，2例非清髓移植者分别于移植后2.5个月和3个月转为完全供者嵌合（donor chimerism，DC）。造血重建后染色体均为正常核型，供受者性别不同者性染色体FISH检测为供者型，供受者性别相同者STR呈供者完全嵌合状态。
19例患者动态随访平均13.8个月（4-35个月），其中14例患者随访平均11.25个月（4-24个月），移植后肿瘤负荷明显下降并持续分子生物学缓解，2例患者分别在移植后4个月及13个月因Ⅳ度肠道移植物抗宿主病和败血症死亡。微小残留病灶（MRD）与时间的关系见表1。另5例MRD持续阳性或出现肿瘤负荷的增加（表2）。例1移植后染色体为持续供者型，而性染色体FISH提示稳定的混合嵌合状态(stable mixed chimerism，SMC)，DD-FISH始终阳性，提示MRD的存在，但无增加趋势。例2于移植后7.5月骨髓原始细胞达15%，融合基因检测由阴转阳性，嵌合比例减少，考虑疾病有进展。例3在移植后100天时骨髓原始细胞达8%，CC正常核型，用保存的骨髓片（骨髓染色体标本遗失）检测发现性染色体FISH 49.5%供者型，DD-FISH显示 31.7% 2O1G1F。例4移植后4个月FISH及DD-FISH检测显示染色体、性染色体出现异常，确诊疾病复发。例5为非清髓移植者，由于移植后骨髓反复干抽，无法进行CC检查，移植后4个月骨髓原始细胞达10%，考虑疾病进展。后4例均立即给予供者淋巴细胞输注联合格列卫，均又达完全细胞遗传学缓解（complete cytogenetic remission，CCR），随访至今例3及例4仍为CCR。例5在移植后12月出现骨痛，骨CT提示左髋关节和右肩胛破坏，左髋关节活检为白血病细胞浸润，而细胞形态学、染色体、嵌合情况、PCR及bcr/abl定量的监测仍呈持续性稳定，给予格列卫、小剂量化疗及局部放疗，症状改善不明显，于移植后17个月死亡。例2经DLI治疗后肿瘤负荷减少，再达分子生物学缓解，但最终因原因停止治疗，移植后14个月死亡。Table 1. Correlation between FISH and the time after allo-HSCT in fourteen patients（略）Table 2. Dynamic detection of cytomorphology，CC，chimerism and FISH in five patients（略）
讨 论
CML异基因造血干细胞移植后的MRD是指形态学和细胞遗传学不能检出的少量白血病细胞［3］，并被认为是复发的根源，故在临床上具有重要的意义。用骨髓涂片、CC及DNA多态性等方法鉴别供、受者细胞敏感性低，而分子技术如PCR及FISH明显提高了检测的敏感性，且性染色体FISH间期细胞遗传学技术广泛用于检测异性间移植的嵌合状态［4］。我们联合CC、FISH及PCR技术动态监测19例CML allo-HSCT后的细胞来源及MRD，反映了移植后不同时期的植入情况和MRD的演变过程。
19例患者移植后性染色体或STR-PCR检测均表明供体源植入成功，肿瘤负荷均明显下降。其中14例患者移植后染色体始终为正常供者核型，植入稳定，移植2月后呈完全供者嵌合，DD-FISH持续阴性。例1移植后染色体始终为正常供者核型，RT-PCR转为阴性，供受者稳定混合嵌合（SMC），DD-FISH检测阳性＞2次。Radich等［5］认为，如bcr/abl融合基因≥2次阳性者复发的风险为78%，1次阳性者为22%，多次检测阴性者为3%。而对于移植后持续为SMC（供者细胞达80%以上）的患者，同样预示着疾病稳定［6］。所以例1如出现MRD增加趋势时，临床上应给予及时治疗。
在复发早期进行免疫（如DLI）和药物（格列卫）治疗能取得较好疗效［7，8］。例2、3各在移植后的7.5个月、100天发现供体源性染色体比例下降，分别为96.0%和49.5%，bcr/abl阳性细胞分别为0.8%和31.7%，而骨髓原始细胞及CC未发现异常。例4移植后的4个月CC为t(9;22)复杂核型，供体源核型及bcr/abl阳性细胞分别为36.4%，RT-PCR转为阳性。该3例患者均立即给予DLI及联合格列卫治疗，结果供体源性染色体比例明显上升，bcr/abl阳性细胞下降为0，RT-PCR又转为阴性。由此可见动态监测DD-FISH能准确地反映体内残存的bcr/abl阳性细胞量的动态变化。巢式PCR可以检测到10-6的bcr/abl细胞，移植后早期(9个月内)RT-PCR阳性并不增加复发的危险，而1年后RT-PCR阳性则预示着复发［9］。虽RT-PCR的敏感性高于FISH，但FISH技术比RT-PCR方法更能反映微量肿瘤克隆的动力改变，而这点在长期随访中显得尤为重要［10］。
例5为CML加速期合并骨髓纤维化，服用格列卫控制病情后进行同性别间的非清髓性移植。移植后4个月发现骨髓原始细胞达10%，由于同期缺少CC及DD-FISH检测的结果，故于格列卫及DLI治疗后用骨髓或外周血标本进行DD-FISH及RT-PCR监测，随访至移植后15个月，未发现MRD增加。但该例患者在移植后12个月出现骨痛，骨活检证实为CML髓外复发。这提示骨髓及外周血的bcr/abl基因及RT-PCR结果并不能反映出髓外的病变。
本组的检测标本多数来源于骨髓，例5因骨髓易干抽或稀释而采用外周血标本或骨髓片。结果表明，标本的来源并不影响监测MRD。Fuehrer等［10］认为，以涂片进行FISH监测可作为干细胞移植后临床的常规监测，而且冻存的涂片并不影响检测结果。至于嵌合状态的检测，骨髓样本的敏感性略高于外周血。
Lion等［11］认为，bcr/abl细胞的消除可导致残留克隆的最终完全根除，而少量恒定不变的bcr/abl提示存在着无致瘤潜能的长期活存的T细胞、B细胞等记忆细胞，也可能反映被抑制的恶性克隆。DD-FISH检测结果阳性提示患者体内存在着bcr/abl细胞，但不能确定其是否具有增殖能力。Chomel等［12］用FISH及定量RT-PCR方法监测21例CCR的CML，发现当bcr/abl融合基因1%-12%时，定量RT-PCR呈阴性或弱阳性，长期稳定CR者bcr-Abl/abl＜0.01%。故主张对于长期CR的CML患者，应该用FISH评价MRD，而用定量RT-PCR估计是否将复发。
STR-PCR与FISH方法可以互补，然而其敏感性比性染色体FISH低5%［10］，本组同性别移植者采用STR-PCR判断嵌合状态，结果均为完全嵌合，而性染色体FISH却能反映出异性间移植者供受者细胞的嵌合比例，根据其量的变化可以推断出肿瘤细胞增殖的情况，这对指导临床治疗是极其重要的。
综上所述，CC、FISH、RT-PCR技术已常规用于CML移植后MRD的监测，其敏感性顺次递增。而FISH技术不但操作简便，样本要求低，骨髓、外周血或涂片均可检测，而且从动态随访结果中能判断出肿瘤细胞动力学改变，从而能及时指导临床治疗。
【】
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