三氧化二砷对骨髓瘤细胞系U266抑制增殖及诱导凋亡的机制研究

【摘要】  本研究探讨三氧化二砷（As2O3）在体外对骨髓瘤细胞系U266的生物学效应及其机制。 用MTT法观察As2O3对U266细胞增殖的影响，用流式细胞术、DNA凝胶电泳法分析As2O3对U266细胞凋亡的影响，以RT?PCR法检测2 μmol/L As2O3不同处理时间对U266细胞人端粒酶逆转录酶蛋白催化亚单位（hTERT）mRNA的表达变化，用Western blot法检测As2O3不同处理时间对U266细胞procaspase?3、bcl?2及hTERT蛋白水平的表达变化。结果表明： As2O3能明显抑制U266细胞增殖，半数抑制浓度（IC50）为2 μmol/L；As2O3能诱导U266细胞凋亡，呈现剂量和时间依赖性；2 μmol/L As2O3不同时间处理U266细胞后procaspase?3蛋白及hTERT mRNA、蛋白表达呈时间依赖性降低,而 bcl?2蛋白表达未发生变化。结论： As2O3通过改变线粒体跨膜电位，触发了U266细胞的线粒体凋亡途径，导致了caspase?3的活化，最终诱导U266细胞凋亡；hTERT表达下调也是As2O3诱导U266细胞凋亡的重要作用机制。

【关键词】  骨髓瘤

    Mechanisms Underlying the Effect of  Arsenic Trioxide on Proliferation Inhibition and Apoptosis Induction in  Myeloma Cell Line U266

        Abstract    The aim of this study  was to explore the  mechanisms underlying effect of arsenic trioxide (As2O3) on myeloma cell line U266 in vitro. The viability and apoptosis of U266 cells were observed by MTT assay, flow cytometry and DNA agarose gel electrophoresis.  The expression of hTERT mRNA was assessed by RT?PCR analysis.  The variation of procaspase?3, bcl?2 and hTERT protein expression were detected by Western blot. The results  indicated that the As2O3 could inhibit the growth of U266 cells significantly  and the concentration of 50% growth inhibition (IC50) was 2 μmol/L. After treatment with 2.5 μmol/L As2O3 at 24, 48 and 72 hours,  a dose? and time?dependent apoptosis of U266 cells could be observed.  After treating  U266 cells with 2 μmol/L As2O3 at different time points, a time?dependent reduction of procaspase?3, hTERT mRNA and protein was found without any  change of    bcl?2  expression.  It is concluded that the  As2O3 can change the mitochondrial transmembrane potential, initiating the mitochondial apoptosis pathway,  leading  in turn  to caspase?3 activation, and inducing the apoptosis of U266 cells. These findings suggest that the reduction of hTERT plays a critical role in the apoptosis of U266 cells induced by As2O3.

    Key words    arsenic trioxid; myeloma; U266 cell; cells apoptosis; caspase?3; hTERT

    多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）是一种以骨髓中单克隆浆细胞恶性增殖并分泌大量单克隆免疫球蛋白为特征的浆细胞肿瘤，多引起广泛骨质破坏、反复感染、贫血、高钙血症、高粘滞血症、肾功能不全等一系列临床表现。目前，MM仍无法治愈。近几年来国内外研究报道，三氧化二砷（As2O3）在复发和难治性MM的中取得了可喜的疗效。相关基础研究也发现，As2O3在体外通过使细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P15、P16和P21重新表达或表达增强，下调癌基因c?myc的表达以及影响黏附分子表达等多种机制影响骨髓瘤细胞增殖周期，促进其凋亡并影响其归巢。但是，As2O3对骨髓瘤细胞的作用机制尚未完全清楚［1-6］。因此，我们以骨髓瘤细胞株U266为体外模型，探讨As2O3对骨髓瘤细胞的作用及相关机制。

    材料和方法

    材料和试剂

    As2O3为黑龙江伊达药业公司产品，用注射用水稀释至1×103μmol/L的储存液，使用时用RPMI 1640培养液稀释至工作浓度。MitoCapture Mitochondrial Apoptosis Detection Kit 购自美国Biovision公司。实验中使用的单克隆抗体及二抗均购自Santa Cruz Biotechnology公司。

    骨髓瘤细胞株U266由上海第二军医大学附属长征血液科侯健教授惠赠。U266细胞培养于含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液中，在37℃、5％ CO2、饱和湿度的孵箱中培养。取对数生长期细胞用于实验。

    As2O3对U266细胞生长影响的MTT法检测

    将不同浓度As2O3处理48小时及一定浓度的As2O3处理不同时间后的样本置于酶标仪上检测波长492 nm的吸光度，每组设6个平行孔，以对照组（0 μmol/L）细胞增殖率为100％，按下述公式细胞增殖率。

    细胞增殖率（％）＝（药物组OD492/对照组OD492）×100%

    细胞凋亡的DNA凝胶电泳检测

    调整U266细胞浓度至2×105/ml ，加入As2O3使终浓度为2 μmol/L，作用0、24、48、72小时后，将5×105细胞移入无菌的1.5 ml Eppendorf管中，4℃ 2000 r／min离心5分钟，弃上清。加入20 μl溶解缓冲液，用移液管尖混匀细胞沉淀。加10 μl  RNA酶A(500 U/ml)，轻弹管尖混匀。37℃孵育90分钟。加10 μl蛋白酶K(20 mg/ml)，轻弹管尖混匀，50℃孵育过夜。样品于20 g/L琼脂糖凝胶，25V，电泳3小时后，在凝胶成像系统中成像观察。

    细胞凋亡的流式细胞术检测

    收集细胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液接种于25 ml培养瓶，细胞浓度为2×105/ml，加入As2O3使终浓度为2 μmol/L和5 μmol/L，空白对照组只含培养液，处理0、24、48、72小时后，收集处理后细胞，计数，然后按MitoCapture Mitochondrial Apoptosis Detection Kit试剂盒说明书进行操作后,立即送流式细胞仪检测。

    hTERT mRNA表达的RT?PCR检测

    收集2 μmol/L As2O3不同时间（0,24,48,72小时）处理组细胞，提取总RNA, 按照Promega公司反转录试剂盒说明书合成cDNA。hTERT基因及内参β?actin基因扩增引物由上海生物工程有限公司合成。hTERT基因上游引物：  5'?CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA?3'，hTERT基因下游引物： 5'?GGATGAAGCGGAGTCTGGA?3',扩增片段145 bp。内参β?actin基因上游引物： 5'?CGCTGCGCTGGTCGTCGACA?3', β?actin基因下游引物： 5'?GTCACGCACGATTTCCCGCT?3',扩增片段为619 bp。PCR条件：94℃变性30秒；60℃退火60秒；72℃延伸60秒；共30个循环,产物在20 g/L琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统显示及分析结果。

    procaspase?3、bcl?2、hTERT蛋白表达的Western blot检测

    收集As2O3处理的U266细胞，提取总蛋白，用考马斯亮蓝法检测蛋白浓度。每孔加等量的蛋白样品，进行不连续的SDS?PAGE电泳，电转移至NC膜，用5％脱脂奶粉PBS于室温下封闭1小时，一抗作用1小时,洗膜30分钟,二抗作用1小时,洗膜30分钟，ECL显色系统（Santa Cruz产品）显示蛋白条带，曝光在柯达胶片上。

    统计学处理

    采用SPSS 11.5统计处理软件进行方差分析，以P<0.05为差别有统计学意义。

    结    果

    As2O3对U266细胞生长和活力的影响

    不同浓度的As2O3处理U266细胞48小时后，U266细胞的增殖率与药物剂量呈负相关，IC50为2  μmol/L（图1）。同时，用2 μmol/L  As2O3处理U266细胞

    Figure 1. Effect of different concentrations of As2O3 on the vitality of the myeloma cell line U266（n=6）.

    后，U266细胞的增殖率与药物处理时间也呈负相关（图2）。

    Figure 2. Effect of 2 μmol/L As2O3 on the vitality of myeloma cell line U266   at different time points（n=6）.

    As2O3诱导U266细胞凋亡的能力

    DNA电泳  U266细胞经2 μmol/L  As2O3处理24小时即出现细胞凋亡特征性条带（ladder），且随着时间的延长细胞凋亡逐渐增加（图3）。

    Figure 3. DNA electrophoresis of U266 cells treated with 2 μmol/L As2O3 at different time points. M: marker. Lane 1: 0 hour. Lane 2: 24 hours. Lane 3: 48 hours. Lane 4: 72 hours.

    流式细胞术检测  2 μmol/L  As2O3处理后，U266细胞凋亡率随处理时间的延长而增加。2 μmol/L  As2O3处理0、24、48、72小时后的凋亡率分别是0.54%、11.06%、26.00%、33.96%。同时，不同浓度As2O3处理48小时后，U266细胞凋亡率随药物剂量的升高而增加。0、2、5 μmol/L As2O3处理48小时的凋亡率分别是0.30%、24.64%、45.78%（图4）。

    As2O3对U266细胞caspase?3及bcl?2蛋白表达的影响

    Western blot 检测显示，2 μmol/L As2O3处理后，U266细胞内procaspase?3蛋白表达下降，提示了caspase?3的活化。同时，我们还观察到在此过程中Bcl?2蛋白的表达未发生明显的变化（图5）。

    Figure 5. Expression of procaspase?3 and Bcl?2 protein in U266 cells treated with 2μmol/L As2O3 at different time points. Lane 1: 0 hour. Lane 2: 6 hours. Lane 3: 12 hours. Lane 4: 24 hours.

    As2O3对U266细胞hTERT mRNA和蛋白表达的影响

    2 μmol/L As2O3处理U266细胞，随着处理时间的延长，hTERT mRNA表达逐渐下降（图6）。同样，hTERT蛋白的表达也随着处理时间的延长而逐渐降低（图7）。

    讨    论

    三氧化二砷(As2O3)俗称砒霜，是我国的传统中药，有上千年的用药史。近几年来，As2O3用于各类恶性肿瘤的是肿瘤防治研究的热点之一。国内外研究显示，As2O3在体外对多种实体瘤和血液肿瘤，

    包括MM，均有作用，但其机制尚未完全清楚。我们的研究也证实，As2O3在体外能抑制骨髓瘤细胞的增殖，诱导骨髓瘤细胞的凋亡，并呈现时间和剂量依赖性［1、3-6］。

    线粒体跨膜电位(Δψm)的变化是细胞凋亡的早期事件,它可以导致促凋亡因子，如细胞色素C、凋亡诱导因子等的释放，激活caspase家族成员，诱导细胞凋亡。我们通过流式细胞术检测As2O3作用后U266细胞Δψm的改变，以反映U266细胞的凋亡率。结果显示，As2O3作用后U266细胞凋亡率与药物处理时间和药物剂量均呈正相关。同时，DNA凝胶电泳也显示As2O3可以诱导骨髓瘤细胞出现典型的DNA梯形条带的凋亡表现。

    Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase?3是关键的执行分子，在细胞凋亡的线粒体、死亡受体途径中发挥作用。 Western blot检测显示： As2O3处理U266细胞6小时后， procaspase?3的表达就开始减少，并随时间的延长逐渐减少，说明caspase?3的激活参与了As2O3诱导U266细胞凋亡的过程。

    Bcl?2蛋白是Bcl?2家族的抑制凋亡成员之一。它定位于线粒体膜上，可以影响线粒体膜的稳定性和PT通道开放，抑制线粒体释放促凋亡蛋白，如：细胞色素C、凋亡诱导因子，抑制促凋亡成员Bax、Bak蛋白的细胞毒作用，从而抑制细胞凋亡，并可以降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。报道，As2O3可以通过下调Bcl?XL、Bcl?2的表达进而诱导肿瘤细胞凋亡［6、7］，但我们研究的结果显示，As2O3激活caspase?3诱导U266细胞凋亡过程中，Bcl?2蛋白的表达未发生变化。因此，As2O3诱发的U266细胞线粒体跨膜电位的改变并不是通过改变Bcl?2蛋白的表达实现的。

    端粒酶在细胞的恶性转化中起到关键作用，其活性调节和肿瘤细胞的生长密切相关。端粒酶催化亚单位hTERT是端粒酶活性的唯一限制性组分。有学者报道，端粒酶有抗凋亡的作用，抑制其活性可以诱导细胞的凋亡［8］。本研究的结果显示：在As2O3诱导U266细胞凋亡的过程中，随着hTERT mRNA和蛋白水平的表达的逐渐下降，U266细胞的凋亡率逐渐增加。这一结果提示，As2O3可以通过抑制hTERT的表达，降低端粒酶的活性，从而诱导或促进U266细胞的凋亡。

    总之，我们的研究发现，As2O3抑制骨髓瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，是通过改变线粒体跨膜电位，触发线粒体凋亡途径，激活caspase?3实现的。此外，As2O3可以通过下调U266细胞hTERT的表达诱导细胞凋亡。As2O3诱导U266细胞凋亡是否通过下调bcl?XL、Mcl?1等Bcl?2家族中的其他抑制凋亡成员和/(或)上调促凋亡成员实现仍需我们进一步研究。

【文献】
  1Rousselot P, Larghero J, Labaume S, et al. Arsenic trioxide is effective in the treatment of multiple myeloma in SCID mice. Eur J Haematol, 2004; 72: 166-171

2Hussein MA, Saleh M, Ravandi F, et al. Phase 2 study of arsenic trioxide in patients with relapsed or refractory multiple myeloma. Br J Haematol, 2004; 125:470-476

3Kajiguchi T, Yamamoto K, Iida S, et al. Sustained activation of c?jun?N?terminal kinase plays a critical role in arsenic trioxide?induced cell apoptosis in multiple myeloma cell lines. Cancer Sci, 2006; 97:540-545

4李翠联，陈世伦，陈文明等. 三氧化二砷改变多发性骨髓瘤细胞基因表达的研究. 中华血液学杂志，2005; 26：209-213

5陈玉宝，傅卫军，侯健等. 三氧化二砷对骨髓瘤细胞周期及其调节蛋白表达的影响. 中华血液学杂志，2003; 24：193-196

6张勇，傅晋翔，李军等. 三氧化二砷诱导体外多发性骨髓瘤细胞凋亡. 江苏医药，2005; 31：738-740

7Akao Y, Mizoguchi H, Kojima S, et al. Arsenic induces apoptosis in B?cell leukemia cell lines in vitro: activation of caspases and downregulation of Bcl?2 protein. Br J Haematol, 1998; 102:1055-1060

8Jiang F, Bao J, Li P, et al. Induction of ovarian cancer cell apoptosis by 1,25?dihydroxyvitamin D3 through the down?regulation of telomerase. J Biol Chem, 2004; 279:53213-53221