Delta模块HLA配型检测方法的建立
作者：吕沁风，章伟，朱发明，严力行
【摘要】 为了建立delta模块配型的检测方法，采用盐析法提取DNA，PCR技术扩增delta模块，GeneScan模式检测PCR产物。 结果表明，在104份随机样本中，PCR扩增出的delta模块具有高度多态性。DNA片段长度范围在81-393 bp，片段数目为6-32个；片段长度集中在81-118 bp，140-175 bp，217-301 bp，340-393 bp 4个区域。结论： 建立的delta模块配型技术是可行的，可以用于造血干细胞移植供者的筛选。首次获得了汉族人群delta模块的数据资料。
【关键词】 delta模块
Establishment of Delta Block Matching Technique
Abstract To establish delta block HLA-matching technique，DNA was extracted from whole blood by salting-out method，delta block was amplified by polymerase chain reaction (PCR)，and PCR product was detected by GeneScan.The results showed that delta block had polymorphism in 104 samples without sibship of the Han people from Zhejiang province.The range of DNA fragment length was 81-393 bp and could be divided into 4 groups: 81-118 bp，140-175 bp，217-301 bp，340-393 bp.The numbers of DNA fragments were 6-32. It is concluded that the method of delta block matching is reliable and can be applied to select donors for the patients to be transplanted.It is the first time to get delta block data of the Han people in China.
Key words delta block; delta block matching; HLA-matching technique; block matching
模块配型技术（block matching）在造血干细胞移植中具有一定的意义。Witt 等［1］研究发现，造血干细胞移植供受者HLA-A、B和DRB 6个位点相合时，受移植病人主要组织相容性复合物（MHC）中的非HLA标记与供者相合可以提高存活率，减少急性GVHD的发生，这种非HLA标记的检测技术被称为模块配型。MHC模块包括alpha、beta、gamma、delta 4个模块，delta模块配型是检测HLA-DR和DQ周围的序列。 国外对beta和delta模块配型技术进行了一些研究，但是国内研究较少。参照有关［1］，我们建立了delta模块配型技术，并对汉族人群样本进行了分析，现将结果报告如下。
材料和方法
样本来源
随机选取104例浙江汉族非血缘关系的人群，抽取全血，EDTA抗凝待用。23对亲缘关系的HLA-A、-B、-DRB 6位点相合的造血干细胞供、受者和26对非亲缘关系的HLA-A、-B、-DRB 6位点相合造血干细胞供、受者，均来自本中心进行HLA配型的患者和供者。
仪器与试剂
MJ-240型DNA扩增仪（美国MJ公司产品）； PCR缓冲液（10×buffer）、10×dNTP、MgCl2、Taq DNA聚合酶（Roche公司产品）。
引物
参照文献[1］ 设计，delta-F为 HEX-5′ GATAGAGAGGATTCTAAATG 3′ ； delta-R为5′ TGGAACAGCCAGAAGGAC 3′，其中delta-F引物5′ 端标记荧光基团HEX。引物由上海基康生物技术公司合成。
DNA抽提方法
按快速盐析法［2］。
PCR扩增
PCR扩增体系
总反应体积为10 μl，其中含10×PCR buffer 1.0 μl，样本DNA 1.0 μl，Taq DNA聚合酶0.4 U；dNTP、MgCl2终浓度分别为0.2 mmol/L和2.0 mmol/L，特异性引物终浓度为0.5 μmol/L。
PCR扩增参数 扩增参数为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，48℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环，冷却至4℃。
产物检测
以ROX500作为分子内标，取产物0.5 μl与上样缓冲液1 μl混合，95℃热变性3分钟后速冷，上ABI PRISM 377测序仪以基因扫描（GeneScan）模式进行PAGE电泳，采用Genetype软件进行数据分析。
结 果
delta模块扩增
每个样本扩增出不同数目和不同长度的DNA片段。样本扩增出的DNA片段个数为6-32个（附表），长度在81-393 bp之间。这些片段构成每个样本各自独特的基因型（附图）。
delta 模块DNA片段长度分布
delta 模块扩增出DNA片段长度大小不一，相对较为集中分布在81-118 bp，140-175 bp，217-301 bp，340-393 bp 4个区域。其中每个样本有固定的峰：81 bp，91 bp和 163 bp。
delta模块检测的重复性
从这些样本中随机选取10个，重复相同的条件3次，每个样本每次均得到相同数目和长度的片段，说明该方法有良好的重复性。Table.Distribution of delta block in the Han people（略）
造血干细胞移植供受者delta模块配型相合情况
23对亲缘关系供受者中有22对供受者Delta模块相合，1对delta模块不同。26对非亲缘关系的造血干细胞供受者中，6对delta模块相合，20对delta模块不同。
讨 论
造血干细胞移植是白血病、重症再生障碍性贫血等疾病的重要手段，大部分病人需寻找无血缘关系的HLA位点相合的供者。国外的研究报道，大约有30％的患者可能找到亲缘关系的供者，而70％的病人则需要寻找非亲缘关系的供者。研究表明，在供受者HLA-A、-B、-DRB 6位点相合的情况下，亲缘关系供者比非亲缘关系供者的效果要好，推测MHC模块是否相合可能是其中的原因之一。近年来，一些研究者关注非HLA区域在移植中的作用，如杀伤性细胞免疫球蛋白受体（KIR）基因和细胞因子基因的多态性、MHC模块等。Trimboli等［3］发现，供、受者HLA-A，-B，-DRB 6位点相合的移植病人，在供、受者beta和delta模块相合的情况下，急性GVHD的发生率和程度比beta模块和（或）delta模块不合的病人显著降低，这表明供、受者delta模块相合可能会降低GVHD的发生，因此在HLA位点配型的基础上，检测供受者delta模块是否相合对于造血干细胞移植供者的选择具有一定的意义。
MHC模块包括alpha、beta、gamma、delta 4个模块，每个模块是研究特定HLA基因周围相关的序列，这些非HLA序列呈现高度的多态性，包含双核苷酸重复序列。检测模块的每条引物在该模块中有2-3个特定的结合位点，重复序列的拷贝数目和引物位置的微小变化都会引起模块检测结果的变化，因此随机人群的模块配型结果都不相同。其中delta模块是研究 HLA-DR和DQ周围的序列，与HLA-DRB1的第2外显子有密切的关系［4，5］。早期Delta模块检测方法常为普通PCR扩增后进行电泳和扫描，得出PCR产物分布的密度和几何强度，然后再扫描分析。该方法灵敏度不高，分辨能力不强，检测的结果为双链DNA的结果。本实验中我们改进了delta模块的配型技术，首次采用HEX荧光基团作为标记物，并在ABI PRISM 377测序仪上用GeneScan模式，检测单链DNA，结果是该法大大提高了delta模块检测的灵敏度和精确性，而且具有很好的重复性，为delta模块的检测提供了一种可行的方法，这将有利于进一步阐明造血干细胞移植与delta模块的关系。
在本实验中我们利用建立的delta模块配型技术检测了部分汉族人群样本，首次获得了汉族人群delta模块的数据资料。结果提示，人群中的delta模块呈现高度多态性。虽然Witt等［1］首先报道delta模块配型相合有利于移植后患者的存活，其实验室也一直在完善方法，但是由于其所获得的数据有限，而且由于建立的方法实验要求较高，操作比较复杂，尚未被大多数实验室所接受，在造血干细胞移植配型中也没有被广泛采用，看来，在这方面尚需要积累一定的数据。本实验中我们用GeneScan技术检测了部分造血干细胞供受者的delta模块相合情况，简化了delta模块配型技术，便于实验操作，但delta模块相合程度与临床移植后的关系仍需积累资料，以便进一步分析。
【参考】
1 Witt C，Sayer D，Trimboli F，et al. Unrelated donors selected prospectively by block-matching have superior bone marrow transplant outcome.Hum Immunol，2000; 61: 85-91
2 朱发明，傅启华，金蕾等.PCR-SSP法检测A1，2BO1，2血型基因型.临床检验杂志，2000； 18:267-269
3 Trimboli F，Witt C，Sayer D，et al. Matching of non-HLA sequences in the MHC may improve survival outcome in HLA matched unrelated bone marrow transplanted recipients.13th IHWS Transplantation of Hematopoietic Stem Cells Joint Report.2002; L20JR335:1-4
4 Tay GK，Witt CS，Christiansen FT，et al. The identification of MHC identical siblings without HLA typing.Exper Hematol，1995;23:1655-166
5 Ketheesan N，Gaudieri S，Witt CS，et al. Reconstruction of the block matching profiles.Hum Immunol，1999; 60: 171-176
