人红细胞冰冻干燥保存研究的进展
【摘要】 目前红细胞临床保存方法主要有低温（4℃）和深低温（-80℃或-196℃）保存。4℃保存时间短，而且容易受到细菌污染；深低温保存大大延长了红细胞保存时间，但需要笨重的低温设备，而且由于保护液中含有甘油等渗透性保护剂，解冻后需要反复洗涤。这些缺陷限制了常规红细胞保存方法在一些特殊情况，例如在战争和灾害条件下的应用。相对于常规保存方法而言，冰冻干燥具有以下优势：重量大大减轻，便于运输，适合室温保存，易于再水化。本文就冰冻干燥保存红细胞研究的进展和所面临的挑战，尤其是最近海藻糖在冰冻干燥保存过程中的应用以及其作用机制进行了综合讨论，从而为一种安全、简单和有效的红细胞冰冻干燥保存方法提出理论指导。
【关键词】 红细胞
Progress in the Study of Lyophilization of Human Red Blood Cells —— Review
Abstract Now the clinical preservation methods of human red blood cells mainly include hypothermic storage (4℃) and cryopreservation (-80℃ or -196℃). The preservation time of hypothermic storage of red blood cells is relatively short and it is easy to be contaminated by microbes. Cryopreservation greatly prolongs the storage time，but it needs heavy storage equipments. Because the protective solutions in cryopreservation contain glycerol，red blood cells need complicated washing in order to remove glycerol. These shortage methods limit their application to some special conditions，such as war or natural disasters. Compared with conventional preservation methods of red blood cells，lyophilization has many advantages such as less weight，convenient transportation，room temperature preservation，prone to be rehydrated. In this review，the progress and challenge in the development of lyophilization of red blood cells，especially application of trehalose and its mechanism in the lyophilization of red blood cells were systematically discussed. This review can provide some theoretic guidance for developing a safe，simple and efficient preservation approach of red blood cells by lyophilization.
Key words red blood cell；lyophilization；trehalose；biomembrane
红细胞是血液中含量最多的细胞，它通过其中的血红蛋白从肺部携带氧气运送到周边器官，在维持人体正常机能起着重要的作用。红细胞是一种高度分化的细胞，它没有细胞核、线粒体等复杂的细胞器，只有一层质膜包裹着血红蛋白。红细胞对于维持生命具有重要意义，人们由于创伤或其他原因造成大量失血而引起红细胞的丢失时，全身器官会氧气供应不足，从而危及生命。及时输注红细胞是这类病例的有效手段。但是，目前在临床上使用的红细胞保存的主要方法有4℃低温和-80℃深低温保存。这些保存技术都有很好的效果，但又存在明显不足：4℃保存时间短，最长不过42天，而且红细胞容易受到污染，从而造成浪费；-80℃保存可以将保存时间延长至10-20年以上，但需要笨重的超低温冰箱等专门设备，运输不方便，能源消耗大。这些缺陷严重限制了常规保存方法在恶劣自然条件或战时条件下的应用［1］。对比之下，冰冻干燥保存的红细胞具有很多优势：便于长期保存，设备重量大大减轻，方便运输，易于消毒，而且在运输过程中不存在振荡性溶血等问题。因此，一旦红细胞冰冻干燥研制成功，必将开创血液供应的新局面。
冰冻干燥对于红细胞而言是一个不利的综合影响过程，细胞在此过程中不但要经受冷冻的打击，而且也要受到干燥的损伤。我们的研究结果表明，在冰冻干燥过程中，干燥对于红细胞的损伤占有主要地位［2］。通常，由于干燥而引起的细胞内水分的蒸发使分子间和分子内的联系发生剧烈变化。在一些生物中，当细胞被干燥时，由于水分的缺失，细胞内的蛋白和膜可能通过氢键结合其他分子来取代它们对水分子的结合，这是生物在不利环境的一种保护适应机制。但是如果没有相应的保护机制，则水分的缺失而导致蛋白质与水分子的结合将被蛋白与蛋白之间的相互作用所取代，从而可能造成蛋白不可逆聚集或者发生变性，这会直接导致干燥后细胞死亡［3］。
研究
红细胞冰冻干燥保存研究经历三个主要发展阶段。这三个主要发展阶段为：
第一阶段：1960年Meryman等［4］首次进行人红细胞的冰冻干燥保存研究。由于甘油的粘度过高，所以他没有添加任何保护剂而直接对血液进行冰冻干燥。Meryman宣称再水化后的细胞回收率为30％-50％。但于1977年在一次关于精子冰冻干燥保存研究的研讨会上，与会者承认红细胞质膜在冰冻干燥过程中受到严重损伤［5］。通常认为，在20世纪80年代以前的研究中，从未获得过一个结构完整的冰冻干燥红细胞。
第二阶段：从1989年开始冰冻干燥保存红细胞研究进入真正具有临床意义的研究阶段。Goodrich等［6，7］在此期间进行了大量实验，先后筛选保护液和再水化液的成分组合，并对保护机制进行初步探索。此后10年，在国外红细胞冰冻干燥保存备受重视，如美国，政府投入大量科研基金，1997-1999年度受美国政府资助的相关研究报告就有20篇之多［8］。但这期间，冰冻干燥保存红细胞研究主要是筛选保护剂及温度等物理参数，而没有深入研究冰冻干燥对红细胞超微结构的影响。Goodrich［6］认为，葡萄糖可以保护红细胞和血红蛋白，而大分子聚合物使保护液呈玻璃化，从而可以有效地保护红细胞。然而，这些研究仍然没有实现冰冻干燥后红细胞可以在室温下长期保存的目标，究其原因主要是大分子聚合物不能进入红细胞内，而只使细胞外液保持玻璃化，所以无法实现对细胞膜的有效保护［9］；另外在室温下样品的氧化问题仍然值得商榷。在此期间冰冻干燥保存的红细胞存活率仅有20％-30％［9］。Rindler等［10］采用麦芽糖和羟乙基淀粉作为主要保护剂进行搁板温度对冰冻干燥保存红细胞影响的研究，结果表明，随着冻干机搁板温度的下降，冰冻干燥后红细胞溶血率也呈下降趋势，当搁板温度为-35℃时，溶血率最低，但当进一步降低温度时，溶血率反而上升。尽管Rindler的试验结果表明，在冰冻干燥过程中当冻干机搁板温度为-35℃时的效果最好，但其溶血率仍然达到85％，最后几乎到无可用的红细胞。我们的研究表明，冰冻干燥的问题主要是质膜受损而造成血红蛋白泄漏。当保护液由大分子聚合物、蛋白和低浓度的渗透性保护剂组成时，冰冻干燥保存红细胞后的上清中游离血红蛋白浓度低于1 g/L，而且细胞回收率达到80％左右，但当将再水化后的红细胞置于4℃下保存不同时间，随着时间的延长，溶血率呈上升趋势［11］。这说明冰冻干燥对红细胞膜造成损伤。从超微结构来看，采用大分子物质作为主要保护剂进行红细胞冰冻干燥保存后的细胞形态分为3类：结构完整（A）、部分完整(B)和血红蛋白完全泄漏(C)，具体见图1。
第三阶段：进入21世纪，研究人员对冷冻和干燥对细胞质膜的影响进行深入的研究［12-14］。在此期间海藻糖和蔗糖等二糖在细胞膜保护方面的作用引起人们广泛兴趣。Wolkers等［14］发现，血小板可以通过随温度变化的液相内吞作用吸收海藻糖，吸收效率可以达到50％以上。吸收海藻糖后的血小板冰冻干燥后的存活率为85％，而且对凝血酶、胶原、ADP和瑞斯托菌素的反应与新鲜血小板相似。受到这项研究的启发，Satpathy等［1］对红细胞对海藻糖的吸收情况进行了初步研究，结果发现随着保护液中海藻糖浓度和孵育温度的变化，红细胞对海藻糖的吸收率也相应的发生变化，当温度为37℃时的吸收率最高，但溶血率也随之上升。这些研究为进一步开展红细胞冰冻干燥保存研究提供了理论依据。
研究的热点——海藻糖
由于红细胞在冰冻干燥保存过程中要经受冷冻和干燥的双重伤害，所以此项研究面临着巨大的困难。海藻糖可能为冰冻干燥保存红细胞开辟新途径。研究人员在一些耐干燥的生物体内发现，当环境极端干燥时其体内海藻糖的浓度可达干重的20％以上。这些生物包括：酵母、一些植物、许多细菌以及一些无脊椎动物（例如水熊等）。在干燥的环境下，海藻糖或其他的二糖形成一种高度粘稠的玻璃化状态，这有利于这些生物在干燥环境中存活［15］。
海藻糖的性质及其作用机制
海藻糖是一种非还原性二糖［16］，由两个葡萄糖残基通过半缩醛羟基相结合，结构为α-D-Glcp-(1→1)- α-D-Glcp。海藻糖的玻璃化转变温度高于蔗糖和麦芽糖，常温下性质稳定。对于海藻糖保护哺乳动物细胞的作用机制，目前有以下几种观点：
Clegg［17］提出一种水分替代假说，他认为甘油、海藻糖以及其他的碳水化合物和氨基酸等保护成分是作为水分替代分子与氢键结合，从而使细胞免受干燥的伤害。根据这个假说，一些耐干燥生物为了避免干燥损伤而在体内积聚海藻糖或蔗糖等碳水化合物，从而替代水分子和氢键结合，当环境中水分充足时，水分子又重新与氢键结合，而此时细胞内的二糖又可以作为能源代谢物质。20世纪80年代，Crowe等［18］认为，在海藻糖存在的条件下生物分子或分子集合体例如细胞膜和蛋白在干燥的环境下可以保持稳定，而且海藻糖的作用效果明显好于其他的糖类。从那时起，海藻糖开始应用于疫苗、脂质体以及人体器官的低温保存，并且取得较好的保护效果。Leslie等［19］报道，在海藻糖存在的条件下冰冻干燥保存细菌可以获得较高的存活率。相反蔗糖对细菌的冰冻干燥保存效果很差。这些工作证明了海藻糖是一种特殊的二糖，其对生物细胞的保护作用明显优于其他糖类。
Branca等［20］认为，对海藻糖的溶液性质进行研究可能有助于解释海藻糖对生物材料的稳定作用。但是这些性质必须在大量水分存在的条件下才和生物稳定有关联。而在干燥情况下，由于水分几乎全部缺失，所以这个假说无法解释干燥环境下海藻糖对细胞材料的稳定作用。
另外，在干燥条件下可降解糖类和蛋白质的所发生的美拉德反应已经被认为是干燥损伤的一个重要原因。海藻糖和蔗糖都是非降解性二糖，这至少可以部分解释为什么在干燥环境中海藻糖和蔗糖可以在一些生物体内积聚，而麦芽糖由于是可降解性二糖，易于发生美拉德反应，因此可能不适合细胞的干燥保存。O′Brien等［21］在海藻糖、蔗糖和葡萄糖存在的条件下建立一个冰冻干燥模型系统，水的活度为0.33，pH值为2.5，结果发现蔗糖的美拉德反应速度和葡萄糖的一样快，而且二者比海藻糖的反应速度大约快2 000倍以上。这个试验充分证明海藻糖在干燥环境中的稳定性优于蔗糖或其他糖类。
相对于其他糖类而言，海藻糖具有较高的玻璃化转变温度，这有利于在常温条件下干燥样品性质的稳定。研究发现，当耐干燥生物处于干燥脱水或高渗透压环境时，海藻糖可以在细胞膜外面形成一种玻璃状的保护层，从而提高了细胞的渗透压耐受性和耐干燥性。这种保护方式使得一些耐干燥生物即使在极端环境中脱水达99％时仍能存活［15］。
Sun等［22］发现脂质体用蔗糖干燥时，在潮湿环境发生严重的溶解，而用海藻糖保存时则没有溶解发生。海藻糖的玻璃化转变温度远高于蔗糖，因此可以预测在蔗糖中加入少量的水可以使其玻璃化转变温度降至保存温度以下，而在海藻糖中加入相同量的水，其玻璃化转变温度仍然在保存温度以上，因此仍保持稳定。当用海藻糖干燥保存的样品保存于20℃时，这个温度比海藻糖的玻璃化转变温度低100℃左右，而当用蔗糖干燥并于20℃下保存时，这个温度仅比蔗糖玻璃化转变温度低45℃左右。这说明在相同的室温保存条件下，海藻糖的干燥保存效果更优于蔗糖。Aldous等［23］认为，既然海藻糖的晶体结构是二水合物，在吸收水分的过程中，一些海藻糖转变成晶体态的二水合物，因此使余下的海藻糖和水分子脱离接触，这也提高了体系的玻璃化程度。Crowe的试验结果表明，在海藻糖干燥保存样品中添加少量水分，结果结晶态的二水合物迅速出现，剩下的海藻糖玻璃化转变温度却仍然保持很高［24］。Buera等［25］提供的证据表明，当用海藻糖干燥保存的蛋白酶样品被升温到玻璃化转变温度以上，其仍保持稳定。因此他们得出结论：玻璃化状态自身不是必要的，而样品保持一种分子间的无序状态而非结晶态是非常重要的。Crowe等［26］认为，玻璃化使干燥样品的成分相互静止，从而避免了在干燥条件下各种成分的过分接触；另外玻璃化自身不能完全实现对生物膜的干燥保护作用。
以上的各种假说均证明海藻糖的冰冻干燥保存效果要优于其他糖类，因此用海藻糖作为一种冰冻干燥保护剂来保存哺乳动物细胞可能是一个非常有前途的方法。红细胞膜是典型的液态镶嵌模型结构，双层磷脂中分布着一些功能蛋白。Wolkers等［12］发现红细胞膜存在两个相变点，分别在14℃和34℃左右。在发生相变时，膜内外磷脂分布发生变化，细胞临时通透性增加，这可能造成血红蛋白的泄漏，但同时也可能引起外源分子进入红细胞。Hays等［27］在冰冻干燥脂质体的再水化过程中也发现类似膜相变现象。以脂质体作为细胞模型进行冰冻干燥，再水化后脂质体的形态完整率为100％，但同时他发现，在溶液状态时脂质体的液晶相到凝胶相的转变温度（Tm）为-1℃。如果不添加海藻糖，当完全干燥时脂质体的Tm升至＋70℃；而如果在保护液中添加海藻糖，则Tm降至-20℃左右，这说明在完全干燥的情况下脂质体仍然保持液晶相，而且再水化时也没有发现相变。但是，在海藻糖存在下，磷脂的Tm降低的机制仍然存在争议，迄今仍然没有一个完美的解释。
总之，目前还没有一种理论可以很好的解释海藻糖的保护机制，我们的观点是，海藻糖之所以具有提高细胞耐干燥能力的效果，可能是以上几种理论共同作用的结果。
海藻糖进入细胞膜的途径
采用海藻糖等二糖作为冰冻干燥保护剂的主要挑战是如何使海藻糖进入细胞质，同时使其在细胞质中达到较高的浓度。目前主要有以下几种方法：Oliver等［28］和Wolkers等［14］采用细胞内吞作用将海藻糖导入人干细胞和血小板中；Beattie等［29］利用胰岛内分泌细胞的质膜在磷脂相变过程中的暂时性通透增加将海藻糖导入细胞质中。同时，他们也发现二甲亚砜能明显提高胰岛细胞对海藻糖的吸收率。他们认为二甲亚砜在此过程中的作用可能是作为一种较弱的表面活性剂。Eroglu等［30］和Chen等［31］利用基因工程合成了一种金黄色葡萄球菌а-溶血素的突变体，这种蛋白可以在细胞膜上打孔，从而可以增加细胞膜的通透性。采用这种方法，他们发现，将海藻糖导入几种人细胞中可以提高其耐干燥性。Guo等［32］和Puhlev等［33］在人上皮纤维原细胞中成功表达了编码6-磷酸海藻糖合成酶和6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因，将此基因片断导入哺乳动物细胞核中，可以合成海藻糖，从而提高了这些细胞的耐干燥性。在采用此基因工程技术处理的细胞系中，细胞内积聚的海藻糖浓度可以达到80 mmol/L，极大提高了这些细胞的渗透压耐受性。在其他的试验中，打孔技术也被应用于将海藻糖导入细胞膜［34］。尽管这种方法可以使海藻糖进入细胞质中，但同时也使细胞的渗透压耐受性降低，可能不适合于红细胞的冰冻干燥。另外，Eroglu等［35］采用显微操作技术将海藻糖注射到人卵母细胞内，然后在低温下保存，结果发现海藻糖可以提高卵母细胞对低温的耐受性。
对于红细胞的冰冻干燥保存而言，由于其结构的特殊性，基因工程技术、显微注射、增加膜通透性等技术不适合于将海藻糖导入红细胞。而利用细胞膜随温度发生的磷脂相变来实现其对海藻糖的吸收可能是一个比较好的途径。
海藻糖在红细胞冰冻干燥保存中的
应用前景分析如何使海藻糖进入红细胞基质中是冰冻干燥保存红细胞能否成功的第一步。红细胞并不具备血小板的内吞作用，由于没有细胞核，也无法通过基因工程技术将编码6-磷酸海藻糖合成酶和6-磷酸海藻糖磷酸酶的基因转入细胞核并且表达。但是Satpathy等［1］根据红细胞膜质膜随温度变化而发生相变的特性，将红细胞在37℃的高浓度的海藻糖缓冲液中保存液中孵育7小时，这种方法可以使细胞内的海藻糖浓度达到50 mmol/L。研究表明，红细胞的这种吸收方式不同于血小板的内吞作用，它是利用渗透压不平衡和膜磷脂相变相结合的办法使外源性海藻糖进入基质中，因此这种方法是一种被动吸收的方法，必须借助于渗透压差和内外源海藻糖的浓度差。
在血小板吸收海藻糖的试验中，外源性海藻糖的浓度只有35 mmol/L［14］，而在红细胞吸收海藻糖的试验中，外源性海藻糖的浓度可以达到1 000 mmol/L左右，是血小板实验中海藻糖浓度的30倍［1］。只有在如此高的浓度下，海藻糖才能高效地进入红细胞基质内，而且高渗对红细胞膜的影响也值得商榷。
另外，红细胞是通过其内在的血红蛋白来携带氧气运输到全身各器官。Goodrich［6］认为，单糖主要是葡萄糖对血红蛋白有很好的保护作用，而二糖是否对血红蛋白有保护作用尚需要研究。
冰冻干燥保存红细胞面临的挑战
尽管红细胞冰冻干燥保存具有重要意义，但在实际研究中仍然面临着巨大的困难，甚至有人对此项研究能否成功持有怀疑态度［36］。
红细胞对高渗和干燥环境极为敏感，尽管人们对红细胞冰冻干燥保存进行了几十年的研究，但目前的结果仍然不能令人满意，尽管目前有许多试验证明海藻糖等二糖可以提高一些细胞的耐干燥性，但仍然存在一些争议，一些人认为海藻糖仅仅可以提高细胞的渗透压耐受性，而无法提高细胞耐干燥性［37］，另外海藻糖是否适合于红细胞的冰冻干燥保存仍是一个未知数。Tunnacliffe等［37］采用海藻糖作为主要保护剂干燥保存小鼠细胞，结果发现当小鼠细胞中的内源性海藻糖浓度达到100 mmol/L时，其细胞的渗透压耐受性有所提高，但即使细胞膜内外都存在高浓度海藻糖时，细胞的耐干燥性也得不到有效提高，这说明在提高细胞耐干燥性方面，只有海藻糖是远远不够的。为什么？因为相对于红细胞和血小板而言，有核细胞结构更复杂，含有一些复杂的细胞器，例如细胞核、线粒体等，因此有核细胞的冰冻干燥具有更大的挑战性，海藻糖等保护剂能否进入细胞核，从而有效保护细胞的基因组结构仍然没有答案。红细胞和血小板的结构非常简单，没有复杂的细胞器，因此只有红细胞的冰冻干燥取得成功，才能为进一步开展有核细胞的冰冻干燥保存打下坚实基础。
概括地说，红细胞冰冻干燥保存主要是保护细胞膜的完整性和血红蛋白的正常功能。Goodrich等［6］认为，葡萄糖可以自由进出红细胞膜，而且可以保护血红蛋白，还可以为红细胞提供代谢能量的来源。所以他在保护液中采用的是单糖。由于单糖的玻璃化转变温度很低，而且容易发生美拉德反应，这些都可能对红细胞膜造成损伤而导致血红蛋白泄漏，因此，Goodrich又在保护液中添加大分子物质以提高保护液的玻璃化转变温度，但是由于大分子物质无法进入细胞膜内，所以其对细胞膜的保护作用是有限的。另外，尽管大分子物质提高保护液的玻璃化程度，但同时也提高了其渗透压，而高渗透压对细胞也有很大的影响。所以我们认为，冰冻干燥保存红细胞的方法首先要满足两个条件：保护剂可以进入细胞质和保护体系要等渗或接近等渗。
红细胞的携氧功能来自于其中的血红蛋白，因此在冰冻干燥过程中如何保护血红蛋白的正常结构具有重要意义。Goodrich等［6］在保护液中添加葡萄糖来保护血红蛋白。二糖是否对血红蛋白有保护作用尚需研究。正常的血红蛋白是四亚级聚合体，如果血红蛋白解聚，其将丧失携氧功能。另外冰冻干燥保存红细胞的一个主要优势是可以室温保存，在保存过程中如何防止血红蛋白氧化甚至变性也是一个重大挑战。
小 结
在红细胞冰冻干燥保存过程中，高浓度的大分子物质尽管可以使细胞外液达到玻璃化，但由于大分子物质无法进入细胞内，所以其对膜的保护作用很有限，因此寻求一种可以进入细胞内，而且对质膜有非常好的保护效果的保护剂非常重要。海藻糖在保护生物材料的稳定性方面具有非常好的效果。将海藻糖用于红细胞冰冻干燥的想法来源于海藻糖在其他哺乳动物细胞或脂质体的应用，所以目前的研究也仅仅是尝试而已，海藻糖是否真正有利于红细胞的冰冻干燥保存还需要实验来检验。
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