转录因子PAX5在儿童急性白血病细胞中的表达
作者：张蓓，帖利军，叶启东，顾龙君，汤静燕，袁向亮，沈立松
【摘要】 为了观察了解儿童急性白血病细胞中转录因子PAX5的表达特性，采用实时定量RT-PCR方法测定了6个血液肿瘤细胞株以及6例正常儿童、58例初发和4例复发急性白血病儿童（其中包括39例B-ALL，10例T-ALL和13例AML）骨髓细胞中PAX5和CD19 mRNA的表达水平。结果表明：在Namalwa（B细胞系）细胞株中，PAX5和CD19 mRNA相对表达量分别为2.35%和2.52%；而在T-和髓系细胞株中几乎不表达。在临床样本中B-ALL组比T-ALL组和AML组的PAX5 mRNA表达高（P=0.029和P=0.013）。T-ALL组和AML组的PAX5 mRNA表达水平均低于正常对照组，而T-ALL组与AML组之间的表达差异无显著意义。在B-ALL患儿中，PAX5 mRNA表达的个体差异很大。此外还发现，初发前组和复发组的B-ALL患儿PAX5 mRNA表达高于化疗完全缓解组（P=0.011和P=0.006）。由于在CD19基因的启动子上有B细胞特异性激活蛋白的结合位点，研究发现在B-ALL中PAX5表达水平与同样用实时定量RT-PCR检测的CD19表达水平之间存在明显的相关性。结论：运用实时定量RT-PCR方法能快速准确地在B-ALL的临床标本中检测和定量PAX5基因的表达。研究中发现部分B-ALL中PAX5 mRNA表达明显升高，因此它可将其作为进一步研究B-ALL发病机理的另一个切入点。
【关键词】 转录因子
Expression of the Transcription Factor PAX5 in Childhood Acute Leukemic Cells
Abstract To investigate transcription factor PAX5 expression characteristics in childhood acute leukemic cells，expression levels of PAX5 and CD19 mRNA in 6 hematological tumor cell lines and bone marrow cells of 6 normal children，58 de novo patients and 4 relapse acute leukemic children，including 39 cases of B-ALL，10 cases of T-ALL and 13 cases of AML，were detected by a real-time RT-PCR. The results showed that PAX5 and CD19 mRNA expression levels were 2.35% and 2.52% in Namalwa (B-cell lines) respectively，but almost not detectable in other T- and myeloid cell lines. Among clinical samples，expression of PAX5 mRNA in B-ALL was significantly higher than that in T-ALL and AML(P=0.029 and P=0.013 respectively). PAX5 expression was significantly lower in T-ALL and AML than that in normal controls.The difference of PAX5 mRNA expression levels between T-ALL and AML was not significant. Individual difference of PAX5 mRNA expression levels in children with B-ALL was great. Moreover，PAX5 mRNA expressions in de novo and relapse patients with B-ALL were significantly higher than those in remission (P=0?011 and P=0.006 respectively). As binding sites for B-cell specific activator protein have been identified in the promoter regions of CD19，the study found that in B-ALL，there was clear correlation between the expression levels of PAX5 and CD19，which was also studied by real-time RT-PCR. It is concluded that PAX5 transcripts are readily detectable and quantifiable in clinical materials with B-ALL by real-time RT-PCR. The strong PAX5 mRNA expression in some B-ALL can be considered to be particularly interesting for further analysis.
Key words transcription factor；PAX5；CD19；acute leukemic cell；real-time RT-PCR
PAX5基因是成对区PAX基因家族的成员，它编码的核反式作用因子——B细胞特异性激活蛋白（B-cell specific activator protein，BSAP）在发育的中枢神经系统、成人睾丸和B淋巴细胞中表达［1］。在B细胞发育过程中，PAX5基因的转录起始于Pro-B（Pre-B1）期，表达于Pre-B和成熟B细胞中，但在浆细胞中不表达［1，2］。BSAP通过与多种B细胞特异性基因（如CD19，VpreB，RAG2，mb-1）启动子或增强子上的BSAP结合位点结合，对这些基因的表达起着调控作用，因而BSAP在B细胞定向分化、发育、增殖、同型转换、免疫球蛋白分泌和终末分化阶段中发挥了重要的作用［1］。近年来研究表明，PAX5基因在成神经管细胞瘤、成人恶性胶质瘤、淋巴瘤和人膀胱移行细胞癌中表达失调，并且与恶性分化程度相关［3］。在血液肿瘤中，以往有关PAX5的研究主要局限于在淋巴瘤中的改变［4-6］。有关PAX5在急性白血病（尤其是急性B淋巴细胞性白血病）中较为详尽的研究迄今为止报道很少［5，6］。本研究在mRNA水平运用实时定量RT-PCR检测血液肿瘤细胞株、儿童急性白血病细胞及正常儿童骨髓细胞中PAX5 mRNA的表达水平，从中了解PAX5在儿童急性白血病中的表达特性，为进一步明确其在急性白血病发生中的作用机制奠定基础，同时也为利用PAX5基因表达产物作为潜在肿瘤标志和基因治疗靶位的应用方面提供依据。
材料和方法
血液肿瘤细胞株及培养
6个血液肿瘤细胞株：Namalwa、SUP-M2、K-562、NB4、HL-60、Jurkat用含2 mmol/L谷氨酰胺和10%胎牛血清的RPMI 1640培养液在37℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养。
临床病例来源
2003年2月至2004年2月新华、上海儿童医学中心收治的初发和复发儿童急性白血病患者62例，其中初发病例58例，复发病例4例；男45例，女17例；年龄4个月-15岁，中位年龄6岁。所有患儿均采用MIC（即细胞形态学、免疫表型、细胞遗传学及相关的分子生物学）分型诊断。按FAB分型，ALL 49例（包括L1 15例，L2 21例，L3 7例，未分亚型者6例）；AML 13例（包括M1 1例，M2a 3例，M2b 1例，M3 2例，M4 2例，M5 3例，M7 1例）。在ALL中，按免疫表型可分为T系-ALL 10例和B系-ALL 39例；39例B系-ALL（CD19+）还可进一步分成4个亚型，分别是： Pro B（CD10-/cytoplasmic μ〖cμ］-）1例，CALL（即Common-B-ALL，CD10+/cμ-）26例，Pre B（CD10+ or -/cμ+）11例和B Cell（即mature-B-Cell，SIg+）1例。另收集13例B系-ALL患儿诱导缓解治疗结束时微小残留病（MRD）监测<0.01%的骨髓标本作治疗后对照，其中男10例，女3例；年龄3-7岁，中位年龄5岁，免疫亚型为：1例Pro B，7例CALL，4例Pre B，1例B Cell。此外，采用6例非血液系统疾病（主要是先天性心脏病手术）患儿的骨髓（BM）和8例门诊做健康体检儿童的外周血（PB）作正常对照，其中男9例，女5例；年龄1-16岁，中位年龄5.5岁。
采集上述正常对照儿童及白血病患儿的骨髓或外周血标本2-3 ml（肝素抗凝），用淋巴细胞分离液室温300×g离心30分钟，分离单个核细胞，再用PBS洗涤2次，取约5×106个细胞加TRIZOL试剂1 ml，混匀后，-80℃保存，待提取RNA之用。初发和复发病例标本中白血病细胞的百分比>80%，必要时B系-ALL标本可通过CD19单克隆抗体免疫磁珠分选法富集白血病细胞（参见Immunotech公司免疫磁珠分选说明书）。
RNA提取和cDNA合成
总RNA提取参照TRIZOL试剂说明书。用紫外分光光度计测RNA浓度（RNA 浓度=A260×40 μg/ml×1/光径×稀释倍数）及纯度（A260/A280比值在1.8-2.0），再用2%琼脂糖凝胶电泳确定RNA质量，而后RNA可储存于-80℃备用。cDNA的合成根据TaqMan反转录试剂盒说明，把0.2 μg总RNA反转录成为单链cDNA。反应体系10 μl，包括10×TaqMan RT缓冲液1 μl，25 mmol/L MgCl2 2.2 μl，dNTPs mixture（2.5 mmol/L each dNTP）2.0 μl，50 μmol/L随机引物0.5 μl，RNase抑制剂（20 U/μl）0.2 μl，MultiScribe逆转录酶（50 U/μl） 0.25 μl，以及已溶解在3.85 μl无RNase水中的0.2 μg RNA。上述混合物孵育在25℃ 10分钟，48℃ 30分钟和95℃ 5分钟。所获得的cDNA可储存于-20℃备用。
实时PCR
实时定量PCR运用TaqMan Universal PCR Master Mix试剂盒在ABI Prism 7000实时荧光定量PCR仪上检测。PAX5、CD19和GAPDH的引物和探针采用TaqMan Assays-on-Demand基因表达产品，其MGB探针以FAM染料作为荧光标记。实时PCR反应体积25 μl各含TaqMan Universal PCR Master Mix（2×）12.5 μl，20×Assay-on-Demand Gene Expression Assay Mix 1.25 μl以及25 ng cDNA模板。PCR反应条件为：预热50℃ 2 分钟（激活uracil-N-glycosylase），95℃ 10分钟（灭活UNG酶，同时激活AmpliTaq Gold DNA Polymerase），紧接着40个循环的95℃ 15秒（变性）和60℃ 1分钟（退火和延伸）。本研究同时把Namalwa细胞株RNA反转录成的cDNA进行系列稀释作为实时PCR扩增模板进行PCR扩增，以证明靶基因PAX5、CD19和内源控制物GAPDH的扩增效率基本相同。由于所有的PCR反应具有基本一致的扩增效率，因此就可以用比较Ct法的相对定量策略，即每个样本PAX5、CD19的相对mRNA表达水平能直接用样本各自的内源控制物GAPDH表达来标准化加入的初始RNA量。简单地说，每个样本中靶基因PAX5、CD19的相对mRNA表达水平可以用以下公式：相对mRNA表达=2-△Ct×100%，式中△Ct值=靶基因Ct值-GAPDH Ct值。
统计学处理
用SAS 6.12统计软件包和Sigma Plot 2001，Version 7.101软件处理数据并绘制统计图，PAX5 mRNA相对表达量用x±SD（%）表示，采用t检验和线性相关与回归进行分析。P≤0.05被认为有统计学意义（双侧检验）。
结 果
血液肿瘤细胞株的PAX5和CD19 mRNA表达
本研究运用实时RT-PCR比较Ct相对定量法，检测了6个血液肿瘤细胞株中PAX5和CD19的mRNA表达，发现人成熟B细胞性淋巴瘤细胞株Namalwa的PAX5和CD19 mRNA相对表达量分别为2.35%和2.52%；而T细胞株（SUP-M2和Jurkat）的PAX5 mRNA表达极微量，分别为0.0033%和0.0018%，且未检测到其相应的CD19 mRNA表达；髓系细胞株（K-562、NB4和HL-60）PAX5 mRNA表达均为阴性。
急性白血病儿童与正常对照儿童的PAX5 mRNA表达
本研究运用实时RT-PCR检测了临床初诊和复发的39例B-ALL、10例T-ALL和13例AML骨髓白血病细胞PAX5 mRNA的相对表达量，同时也检测了6例非血液系统疾病儿童骨髓和8例健康儿童外周血单个核细胞PAX5 mRNA的相对表达量作正常对照。图1显示了上述不同类型的急性白血病和正常对照中PAX5 mRNA相对表达量的分布，从中可见B-ALL的PAX5 mRNA相对表达量范围变化很大，从（0.12-61.13）%不等。表1列出了急性白血病儿童与正常对照儿童平均PAX5 mRNA表达量的比较。统计表明： B-ALL组的平均PAX5 mRNA表达量比T-ALL组和AML组高（P<0.05），而与正常对照BM和PB组的平均表达量差异无显著意义（P>0.05）。T-ALL组与AML组之间的平均PAX5 mRNA表达量差异也无显著意义（P>0.05），但其分别与正常对照BM和PB组的平均表达量差异有非常显著意义（P<0.01）。另外还发现正常对照BM组与PB组的平均PAX5 mRNA表达量差异在统计学有显著意义（P=0.043）。Table 1. Comparison of PAX5 mRNA expression between acute leukemia and normal control（略）
B-ALL儿童的PAX5 mRNA表达
初发和复发B-ALL患儿骨髓白血病细胞的PAX5 mRNA表达范围变化很大，从0.12%到61.13%，平均表达（9.65±13.21）%，不存在性别差异（男女患儿平均表达分别为（8.53±12.13）%、（13.41±16.58）%，P=0.337）。本研究仅检测了1例<1岁男性患儿，PAX5 mRNA表达为5.37%；1-10岁组30例，平均PAX5 mRNA表达为（10.98±14.53）%；8例>10岁患儿的平均PAX5 mRNA表达为（5.22±6.34）%，两组之间差异无显著意义（P=0.284）。按照FAB分型，L1、L2和L3 3组之间的PAX5 mRNA表达经两两比较差异均无显著性意义（P>0.05）。
比较不同化疗阶段B-ALL患儿PAX5 mRNA表达发现：初诊化疗前组患儿与复发组患儿的平均PAX5 mRNA表达差异无显著意义（P>0.05），而化疗缓解（MRD<0.01%）组患儿的平均PAX5 mRNA表达下降，与初诊化疗前组和复发组患儿的差异均具有显著意义（P<0.05）（表2）。Table 2. Comparison of PAX5 mRNA expressions in B-ALL at different stages of the disease（略）
本研究在运用实时RT-PCR检测临床病例和正常对照的样本中PAX5 mRNA相对表达量的同时，还检测了样本中CD19 mRNA相对表达量。通过统计分析39例B-ALL样本中PAX5 mRNA与CD19 mRNA相对表达量之间的关系发现：在mRNA水平上PAX5的表达与CD19的表达之间存在明显的相关关系（r=0.516，P=0.0008）（图2）。
讨 论
儿童急性白血病（以急性B淋巴细胞性白血病为主）是严重危害儿童生命的恶性肿瘤。随着医学的进步，当前以化疗为主要手段的综合已使大多数急性白血病患儿经治疗后可获得缓解，但最终仍有部分患儿复发。对于白血病的确切发病机制目前尚不清楚，因此从细胞发育、增殖、分化等方面多角度深入研究儿童急性白血病发生中的表达特性，从中逐步明确其发生机理，将为白血病的治疗提供新的思路并将提高白血病的治愈率及长期无病生存率。
在淋巴造血系统中，PAX5/BSAP被认为是B细胞特异性的标志。目前临床上对于PAX5/BSAP的研究主要集中于运用免疫组织化学检测正常淋巴组织细胞和血液肿瘤（主要是淋巴瘤）组织细胞中BSAP的表达［4-6］。Krenacs等［4］和Torlakovic等［5］对较大数量的多种亚型淋巴组织标本中BSAP表达的研究显示，BSAP仅表达于正常和肿瘤的B细胞中，且在不同的B细胞亚类和B细胞非何杰金氏淋巴瘤亚型中PAX5表达的水平各不相同，而在T细胞和T细胞性淋巴瘤细胞中表达为阴性。然而新近同样的研究，Zhang等［6］的报告却显示PAX5在1个T细胞性淋巴瘤细胞中表达，并且在T-ALL和AML中也有50%表达PAX5。此外，Hamada等［7］报道，运用RT-PCR能快速地在不同种类B细胞性肿瘤的临床标本中检测到PAX5转录。
本研究首先运用了实时RT-PCR比较Ct法的定量策略来检测血液肿瘤细胞株中PAX5和CD19的mRNA相对表达量，在6个血液肿瘤细胞株中Namalwa（B细胞系）的PAX5和CD19 mRNA相对表达量分别为2.35%和2.52%，而T系和髓系细胞株几乎不表达，这与Hamada等［7］的研究结果相近。
本研究还运用实时RT-PCR来测定临床初诊和复发的儿童急性白血病骨髓细胞中PAX5 mRNA的表达，并以正常BM和PB的单个核细胞作对照。研究发现：在不同白血病和正常对照中平均PAX5 mRNA表达高低依次顺序为B-ALL组>Normal BM组>Normal PB组>T-ALL组>AML组。由此可见，在儿童急性白血病中，PAX5主要在B-ALL中表达，而T-ALL和AML中表达均极低；研究中发现部分B-ALL中PAX5 mRNA表达明显升高，因此可将其作为进一步研究B-ALL发病机理的另一个切入点。
此外，不同化疗阶段B-ALL的PAX5 mRNA表达的分析发现：初诊化疗前组和复发组的平均PAX5 mRNA表达比化疗缓解组的表达高。因此，对于ALL儿童最好应在初诊化疗前即测定PAX5 mRNA表达，其后作动态观察，这样可以评估治疗反应，利于及时调整化疗方案。
在许多B细胞特异性基因的启动子上目前已发现多种BSAP的结合位点［8］，其中包括CD19基因启动子上的BSAP结合位点［9］，通过此位点BSAP对CD19表达起调节作用。CD19是B细胞表面信号传导系统的一个主要成分，它的活化启动多种细胞内信号传导途径［10］。本研究在用实时RT-PCR研究B-ALL中PAX5 mRNA表达的同时，也检测了相应的CD19 mRNA表达，经统计分析两者之间的表达存在明显的相关性，与此前的有关研究报道［6，7］不甚一致，其可能的原因是： ①研究对象不同，此前的报道主要是淋巴瘤，且研究标本量少；本研究对象则为B-ALL，标本量相对较多；②研究方法不同，此前的报道运用的是Northern blot，传统PCR和流式细胞术；本研究运用实时RT-PCR。鉴于在B-ALL中PAX5与CD19 mRNA表达之间存在的明显相关性，可以认为，在B-ALL中PAX5通过调控其目标基因CD19表达来影响细胞内多种信号传导途径，进一步可能影响肿瘤的发展。
由于目前未见有关详细研究白血病中PAX5 mRNA表达特性的报道，因此没有与本研究结果可以相比较的相关资料可资参照分析。也就是说，本研究可能是首次较为详尽地报道运用实时RT-PCR评估急性白血病细胞中PAX5 mRNA的表达。至于在B-ALL中PAX5表达的更加确切的和作用，还有待于对更多临床样本进行较为长期的观察研究。
【文献】
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6Zhang X，Lin Z，Kim I. Pax5 expression in non-Hodgkin’s lymphomas and acute leukemias. J Korean Med Sci，2003；18:804-808
7Hamada T，Yonetani N，Ueda C，et al.Expression of the PAX5/BSAP transcription factor in haematological tumour cells and further molecular characterization of the t(9；14)(p13；q32) translocation in B-cell non-Hodgkin’s lymphoma. Br J Haematol，1998；102:691-700
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