巢式MSP法检测恶性血液病细胞株p16基因启动子甲基化状态的研究
作者：周华蓉，沈建箴，付海英，叶宝国，范丽萍，林福安
【摘要】 本研究应用改进的甲基化特异性PCR（MSP）法，即巢式甲基化特异性PCR法检测6种肿瘤细胞株p16基因启动子的甲基化状态效率，探讨其在筛选p16基因启动子高甲基化的肿瘤细胞株，及将其作为研究基因甲基化与表达关系的理想细胞模型中的应用。6种肿瘤细胞株基因组DNA经碱变性后以亚硫酸盐修饰，再用巢式甲基化特异性聚合酶链反应扩增，分析检测其p16启动子区CpG岛的甲基化状态。结果表明： CA46、U266都有不同程度的p16基因启动子区甲基化，而Molt4、 K562、HL-60、Jurkat的p16基因启动子区均未甲基化。结论： 用巢式甲基化特异性PCR可以准确的检测出恶性血液病细胞株p16基因的甲基化状态，方法简单，灵敏且重复性强，可以广泛用于筛选各种p16基因启动子区甲基化的恶性血液病细胞株以及恶性血液病诊断。
【关键词】 巢式甲基化特异性聚合酶链反应
Detection of Promoter Methylation of p16 Gene in Hematological Malignant Cell Lines by Nested Methylation Specific Polymerase Chain Reaction
Abstract This study was aimed to investigate the effeciency of modified methylation-specific polymerase chain reaction i.e.nested methylation-specific polymrase chain reaction，used to detect the promoter methylation of p16 gene in six hematological malignant cell lines，and to explore the application in selection of hematological malignant cell lines with promoter hypermethylation，and make them to be an idel cell models for studying the relationship between gene methylation and expression. DNAs were denatured by NaOH and then were subjected to bisulfite modification and a nested-MSP was used to amplify the promoter region，nested MSP product of p16 gene promoter was analyzed and sequenced.The results showed that the hypermethylation of p16 gene was detected in CA46 and U266，however，Molt4，K562，HL-60 and Jurkat cell lines were unmethylated. In conclusion，p16 gene methylation in hematological malignant cell lines can be perfectly detected by nested-MSP method，which is simple，sensitive and specific for screening all kinds of hematological malignant cell lines with p16 gene methylated.
Key words nested methylation specific polymerase chain reaction; hematological malignant cell line; p16 gene; gene methylation
目前分析DNA甲基化最常用的方法是甲基化特异性PCR（MSP），在此基础上产生改进的巢式甲基化特异性PCR（nMSP）具有更高的灵敏度和特异性，逐渐被应用于甲基化启动子的分析和检测中，MSP法可以检测出1/1000的甲基化等位基因片段，而nMSP法灵敏度又是MSP法的50倍，因此可以检测出1/50 000的甲基化等位基因片段［1］，适合用于筛选p16基因启动子区甲基化的肿瘤细胞株。本研究主要探索应用巢式MSP检测6种恶性血液病细胞株p16基因启动子区甲基化状态，从而筛选出可以用于甲基化与表达之间关系研究的理想细胞模型。
材料和方法
材料
细胞系
所用7株肿瘤细胞株为本所冻存的细胞株，分别是Molt4、HL-60、K562、Jurkat淋巴瘤、CA46、Hep-G2、U266。
主要试剂
RPMI 1640培养液购自Gibco公司，胎牛血清为杭州四季青产品，蛋白酶K为Amerco公司产品，Taq酶为TaKaRa公司生产。DNA纯化试剂盒（Wizard DNA Clean-Up System）购自Promega公司。
主要仪器
CO2培养箱（WJ-3D），凝胶成像分析扫描仪（Gel Doc 1000型，BIO-Rad），PCR热循环仪为PE公司产品，型号为2400，UV2100 紫外分光光度仪购自日本Shimadzu公司。
PCR引物
由上海生物工程公司合成，序列见表1。Table 1.Primers of methylation-specific PCR of p16 gene （略）
方法
细胞培养
7种细胞分别放置在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液中，37℃、5％ CO2、饱和湿度条件下培养，保持实验使用细胞处于对数生长期。
肿瘤细胞基因组DNA的提取
采用酚－氯仿抽提法提取。
基因组DNA的亚硫酸盐修饰
Herman等［2］的方法，取1-2 μg DNA，加超纯水至50 μl。加3 mol/L的 NaOH 5.5 μl，37℃放置10分钟。向碱变性的DNA中加入新配制的30 μl 10 mmol/L的氢醌和520 μl 3 mol/L亚硫酸氢钠，以矿物油2滴覆盖液面，50℃放置16到18小时。再用Wizard DNA Clean-Up System 纯化，纯化后的DNA加5.5 μl 3 mol/L的NaOH，室温放置15分钟，最后加33 μl 10 mol/L NH4AC(pH 7.0)，用预冷的乙醇沉淀DNA，并以30 μl超纯水溶解，-20℃储存备用。
巢式甲基化特异性PCR扩增
参考报道的方法进行［1］。 第1轮巢式MSP反应扩增1段p16基因启动子区富含CG的序列，片段长度为280 bp，p16F1和p16F2这对引物只识别亚硫酸盐修饰后的模板，而不能区分甲基化和非甲基化的等位基因。将第1轮PCR产物稀释30倍，取2 μl作为第2轮巢式MSP反应的模板，第2轮巢式PCR使用的引物分别是是甲基化（p16M1，p16M2）和非甲基化(p16U1，p16U2)特异性引物，第1轮和第2轮巢式PCR的引物序列见表1。两轮巢式PCR反应的体系均为25 μl，其中10×Buffer（Tris-HCl 100 mmol/L，KCl 500 mmol/L，MgCl2 15 mmol/L） 2.5 μl，dNTP 2.5 mmol/L，各引物300 ng，Taq DNA聚合酶0.6 U，模板DNA 50 ng。PCR扩增在Gene Amp 2400 PCR System 上进行，反应步骤如下： 95℃预变性10分钟，然后95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40个循环，最后，72℃再延伸10分钟。第2轮巢式MSP分别使用非甲基化引物p16U1、p16U2和甲基化引物p16M1、p16M2进行扩增，除引物外反应体系其它部分与第1轮相同，反应条件与第1轮不同的是非甲基化引物退火温度为62℃，甲基化引物退火温度为67℃。同时，以正常人外周血淋巴细胞DNA为阴性对照，水作空白对照，p16基因高度甲基化的Hep-G2作为阳性对照。最后取8 μl PCR产物在2％的琼脂糖凝胶上电泳，在Gel Doc 1000型凝胶图像分析仪上观察并照相。
PCR产物的序列分析
第2轮巢式MSP甲基化和非甲基化引物扩增出的随机产物挑选2个由上海博亚生物技术有限公司克隆后进行序列分析。
结果
MSP扩增的结果
第1轮巢式甲基化特异性PCR用p16F扩增得280 bp富含CpG岛的p16基因启动子区片段，在所有标本均可扩增出相应片段。第2轮巢式甲基化特异性PCR以p16M或p16U为特异性引物，以第1轮巢式MSP产物为模板，各肿瘤细胞株扩增结果有3种：一种是只有p16M扩增出相应片段，它是U266；另一种是p16M和p16U都扩增出相应片段，它是CA46;再一种情况是p16M无扩增而p16U有扩增，它们是K562、molt4、HL-60、Jurkat淋巴瘤。MSP扩增结果见图1。
根据MSP引物设计，以上用p16M和p16U都扩增出目的片段的肿瘤细胞，其p16基因即表明存在甲基化。
MSP分析的可靠性
为证实MSP分析可靠性，我们随机挑选了2个分别用p16M和p16U引物扩增的PCR产物，经克隆后测序，结果见图2，证明第2轮MSP产物是p16基因启动子区的部分序列，其分析结果完全可靠。甲基化的p16基因，其CpG中的C未被硫化改变，仍为C。而非甲基化序列没有C，其C经修饰后转变成T。两结果对比证实，有CpG二核苷酸存在于序列中则为甲基化的CpG，而有TpG存在于序列中则为非甲基化的CpG。
以上测序结果显示p16基因启动子5’端片段，非甲基化片段中所有的胞嘧啶都转变成胸腺嘧啶，甲基化片段中CpG 二核苷酸的胞嘧啶保持不变。
讨论
研究DNA甲基化的方法主要有甲基化敏感的限制性内切酶酶切法和甲基化特异性PCR（MSP），早期使用的甲基化敏感性限制性内切酶联合Southern杂交技术需要大量高分子DNA，且只在相当比例的等位基因甲基化的情况下才能检测到，并且只能提供甲基化敏感限制性内切酶能识别序列的CpG位点的信息，还可能因酶切不全而产生假阳性现象。用重亚硫酸盐诱导基因组DNA氧化脱氨基的方法使胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不发生转化的方法最早是由Frommer等［3］提出，后由Herman等［2］并改进形成现在的MSP法。其原理是用亚硫酸盐转化未甲基化胞嘧啶成为尿嘧啶，并在随后进行的PCR反应过程中转变成胸腺嘧啶，而甲基化胞嘧啶不发生这种转化。这种方法适用于任何给定的基因组靶序列5’ 端CpG岛甲基化的详细分析。MSP法简单、灵敏、特异性高，需要标本量少，可以检测比例为1/1000的甲基化的等位基因片段［2］，在此基础上的改进方法巢式甲基化特异性PCR法比MSP法扩增倍数更大，它的灵敏度是MSP法的50倍，可以检测出1/50 000的甲基化等位基因片段，即使 MSP法修饰DNA的过程中DNA降解了84％-96％［4］，仅剩余微量的DNA，巢式MSP仍然可以扩增出大量的目的片段，重复性强，很适合用于筛选p16基因启动子区甲基化的肿瘤细胞株。此外，巢式MSP法先对待测区域进行一轮扩增，再对第1轮产物进行第2次扩增，与原来的MSP法直接对全长基因组进行特异性扩增相比，该法检测的敏感性大为提高。
有证据表明，人类癌症的过程与抑癌基因启动子高甲基化及癌基因启动子低甲基化有关［5-7］。p16基因在细胞周期的调控中起关键性负调控作用，其基因产物P16蛋白主要抑制CDK4介导的Rb基因蛋白产物的磷酸化，阻止细胞从G1期进入S期。而p16基因是目前已知大多数肿瘤中失活频率最高的肿瘤抑制基因之一，其启动子区甲基化在许多肿瘤中都是一个早发和频发事件。目前已有实验室对石蜡标本、新鲜组织标本和血标本进行了p16基因启动子甲基化方面的检测，探讨其用于肿瘤的辅助诊断的价值。p16基因启动子区甲基化与否有可能成为肿瘤防治的一个重要的生物学标记，而本研究主要使用巢式MSP检测p16基因启动子区CpG岛甲基化状态，筛选出基因启动子高甲基化的的特定肿瘤细胞株作为药物试验理想的细胞模型，为研究基因组甲基化模式和进行药物逆转甲基化实验打下基础。
此外，本研究选取的细胞株有T淋巴细胞白血病（Molt4）、急性髓系白血病（HL-60）、慢性髓系白血病（K562）、T细胞淋巴瘤（Jurkat淋巴瘤）、B细胞淋巴瘤（CA46，属于Burkitt淋巴瘤）和骨髓瘤细胞株（U266），因此检测结果具有一定的代表性意义。本研究发现，以上各种恶性血液病细胞株只在2种血液实体瘤细胞中发现了甲基化p16，而非实体瘤细胞则没有p16甲基化，特别是淋巴瘤中B细胞淋巴瘤细胞出现p16甲基化，与报道相符［7］，这似乎提示p16甲基化是血液病的实体瘤的特异性检测指标，同时由于B细胞淋巴瘤高发，因此它也可以用于鉴别淋巴瘤类型。
虽然如此，MSP法仍需不断完善，由于MSP特异性引物只能依据已知基因启动子序列来设计，因而现有的MSP法无法检测到未知基因的甲基化状态［8］，不能评估启动子甲基化的整体水平［9］，所以MSP法仍有一定的局限性。目前检测甲基化的方法仍在改进，相信不久的将来会有更多更好的方法用于研究基因的甲基化。
【文献】
1Palmisano WA，Divine KK，Saccomanno G，et al. Predicting lung cancer by detecting aberrant promoter methylation in sputum.Cancer Res，2000; 60:5954-5958
2Herman JG，Graff JR，Myohanen S，et al.Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG island. Proc Natl Acad Sci USA，1996; 93:9821-9826
3Frommer M，McDonald LE，Millar DS，et al.A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.Proc Natl Acad Sci USA，1992; 89:1827-1831
4Grunau C，Clark SJ，Rosenthal A.Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters.Nucleic Acids Res，2001; 29:E65
5Ng MH，Chung YF，Lo KW，et al.Frequent hypermethylation of p16 and p15 genes in multiple myeloma.Blood，1997; 89:2500-2506.
6Yang ZH，Shan Z，Yu J，et al.The methylation profiles of the promoter CpG islands of nine tumor associated genes correlate with their expressions in three lung cancer cell lines.Tumor，2004; 3:216-220
7Rush LJ，Plass C.Alterations of DNA methylation in hematologic malignancies. Cancer Lett，2002; 185:1-12
8Oakeley EJ.DNA methylation analysis: a review of current metho-dologies.Pharmacol Ther，1999; 84:389-400
9Fruhwald MC，Plass C.Global and gene-specific methylation patterns in cancer: aspects of tumor biology and clinical potential，Mol Genet Metab，2002; 75:1-16
