存活蛋白重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞的表达
作者：朱雄鹏，陈志哲，林旭，胡建达，李纯团，杨婷，许贞书，吕璐璐，陈彩平，张浪辉
【摘要】 本研究旨在构建含有人存活蛋白（survivin）基因的重组腺病毒载体，并探讨其在转染树突状细胞中的表达。以质粒pcDNA3.0-survivin为模板，通过PCR 扩增获得survivin基因全长序列。PCR产物回收后经酶切，定向插入腺病毒穿梭质粒，获得重组质粒pShuttle-CMV-survivin。通过双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后，将正确重组体pShuttle-CMV-survivin 转化E.coli BJ5183 菌（含腺病毒骨架质粒）并进行同源重组，然后筛选阳性克隆，提取质粒，将此重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化，用脂质体LipofectamineTM 2000介导转染293 细胞。制备病毒上清并测定其滴度，将病毒上清转染树突状细胞，应用Western blot方法分析survivin的表达。结果表明：成功构建了含有人survivin基因的重组腺病毒，病毒滴度为： 2.65×109pfu/ml。Western blot鉴定显示，经重组腺病毒转染的DC可有效表达survivin。结论：含survivin基因的重组腺病毒载体的构建成功，为下一步开展抗白血病免疫研究奠定实验基础。
【关键词】 腺病毒载体；存活蛋白基因；树突状细胞
Construction of Recombinant Adenovirus Vector Containing Human Survivin Gene and Its Expression in Dentritic Cells
Abstract The study was aimed to construct the recombinant adenovirus vectors containing human survivin gene，and to investigate their expression in transfected dentritic cells. Full length cDNA encoding survivin was obtained by PCR amplification from plasmid pcDNA3.0-survivin. The PCR product was restricted，and then inserted into pShuttle-CMV. The plasmids of pShuttle-CMV-survivin were linearized with PmeⅠ，and the fragment containing survivin was ligated with pShuttle-CMV and transfected into E.coli BJ5183. After homologous recombination in bacteria，the extracted plasmid from the positive bacteria were linearized with PacⅠ，transfected into HEK293 cells with liposome LipofectamineTM 2000. Then，the harvested adenovirus supernatants were transfected into dendritic cells. The results showed that the recombinant adenovirus-survivin was constructed successfully and its titer was about 2.65×109 pfu/ ml. The expression of survivin in transfected dentritic cells was confirmed by Western blot analysis. It is concluded that the recombinant adenovirus vector containing human survivin was constructed successfully，which may provide preliminary laboratory evidence for anti-leukemia immunotherapy.
Key words adenovirus vector; survivin gene; dendritic cell
重组腺病毒载体具有宿主细胞范围广、高转移效率、高滴度和高表达等优点，是目前基因研究中应用最为广泛的载体之一［1-3］。存活蛋白（survivin）基因是肿瘤组织较为特异的基因，因而其编码蛋白survivin成为肿瘤较理想的靶抗原之一。为开展树突状细胞(DC)介导的抗白血病免疫治疗，我们采用一种新的细菌内同源重组制备重组腺病毒的AdEasyTM XL系统，构建了survivin基因重组腺病毒，制备了高滴度的病毒上清，并感染人树突状细胞，为下一步开展DC瘤苗治疗研究提供实验基础。
材料和方法
材料
质粒pcDNA 3.0-survivin由第四军医大学西京儿科、全军优生优育研究所成胜权副教授惠赠；浓缩白细胞由省血液中心提供； AdEasyTM XL腺病毒系统为Stratagene公司产品；高保真DNA聚合酶为Invitrogen公司产品；普通Taq酶为晶美公司产品；内切酶 KpnⅠ、HindⅢ、PmeⅠ、PacⅠ、T4连接酶为BioLabs产品；纯化试剂盒、小量抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒购于中科开瑞公司；质脂体、低熔点琼脂糖为Invitrogen公司产品； PCR纯化试剂盒、β-半乳糖苷酶检测试剂盒为Stratagene公司产品；总蛋白裂解酶、蛋白酶抑制剂为美国Pierce公司产品；兔抗人Survivin多克隆抗体为北京中杉生物技术公司产品；辣根标记山羊抗兔IgG、Western-Blotting lunimol试剂为Santa Cruz公司产品。
引物设计
根据GenBank中survivin mRNA的系列BC034148及腺病毒穿梭载体（pShuttle-CMV vector）的酶切位点（Kpn1和HindⅢ）分别设计了引物，F： 5’-CGGGGTACCATGGGTGCCCCGACGTTG-3’，R： 5’-CCCAAGCTTTCAATCCATGGCAGCCAG-3’。
目的片段的获得
以pcDNA3.0-survivin为模板，用合成的引物作PCR扩增，体系为25 μl，其中含10 ×buffer 2.5 μl，dNTP (10 mmol/L) 0.5 μl，模板质粒0.5 μl，上下游引物各0.5 μl，Taq 酶0.1 μl。热循环程序为: 94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30 个循环后，72 ℃再延伸7分钟，4 ℃保存。取10 μl PCR反应液在1%琼脂糖中进行电泳。然后采用的纯化试剂盒，按照说明书对PCR产物进行纯化。
穿梭载体的构建
用Kpn1和HindⅢ两种内切酶对survivin纯化产物和pShuttle-CMV vector进行酶切，将得到的酶切产物用凝胶回收试剂盒进行回收。利用小牛肠碱性磷酸酶对载体酶切片段进行磷酸化处理，得到的产物片段survivin和载体，用T4 DNA连接酶在4℃条件下进行连接，转化感受态大肠杆菌DH5α细胞，并通过带有卡那霉素（50 μg/ml）的LB平板筛选出带有重组质粒的细菌。然后以菌液为模板，用腺病毒载体通用引物进行扩增以筛选出带有目的片段的细菌，用小量抽提试剂盒抽提质粒得到重组质粒（pShuttle-CMV-survivin），送泰京公司测序。
腺病毒表达载体的构建
同源重组
将带有正确目的片段的穿梭载体（pShuttle-CMV-survivin）和对照质粒（pShuttle-CMV）分别用Pme1进行线性化，然后从凝胶中回收，并用来分别转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞（已含有病毒质粒AdEasy-Vector）。用加卡那霉素（50 μg/ml）的LB平板筛选带有同源重组质粒的E.coli BJ5183，抽提质粒，Pac1酶切鉴定。同源重组成功的质粒，用腺病毒通用引物进行PCR扩增，以确定重组质粒是否带有目的片段。之后用大抽质粒试剂盒HiSpeedTM Plasmid Purification kit，分别从含有同源重组质粒（Ad-CMV-survivin、Ad-CMV）的菌液进行大量质粒抽提，以备转染293细胞包装病毒时用。
腺病毒的包装
取同源重组质粒5 μg，用3 μl的内切酶Pac1进行线性化，然后用PCR纯化试剂盒进行纯化，将纯化产物利用质脂体LipofectamineTM 2000进行转染汇合度达到70%的293细胞。到第8天时，细胞大部分飘浮。用滴管把剩下贴壁的细胞吹起，收集细胞，离心，弃掉上清，加入1 ml PBS，重悬细胞，然后移到1.5 ml EP管中。在-70℃冰箱与37℃水浴反复冻融细胞4次，12 000×g离心10分钟，收集上清，即为原代病毒上清（Ad-CMV-survivin、Ad-CMV），置-70℃冰箱中保存。
腺病毒的扩增、滴度测定
将得到的原代病毒上清转染汇合度为70%的293细胞，按以上方法收集病毒。然后再将得到的病毒上清转染两瓶50 cm2 T形瓶、汇合度为70%的293细胞，利用空斑测定法对收集的病毒上清进行滴度测定，最后放置-70℃冰箱中保存。
腺病毒介导survivin在DC的表达
DC的诱导
利用淋巴细胞分离液从浓缩白细胞中分离出单个核细胞，利用贴壁法得到单核细胞，加入生长因子GM-CSF、IL-4到培养液中混合培养，浓度皆为1 000 U/ml，隔天半换液，并补充生长因子。到第7天加入TNF-α，使其终浓度达50 ng/ml，到第9天收集细胞。
外源基因survivin蛋白表达的Western blot鉴定
在DC培养到第7天加入TNF-α的同时，按MOI为100分别用腺病毒Ad-CMV-survivin、Ad-CMV感染DC。第9天收集转染及未转染Ad-SVV(survivin)病毒的DC，加入总蛋白裂解酶100 μl和蛋白酶抑制剂1 μl，冰浴30分钟，4℃，13 000×g，离心10分钟。取上清直接于凝胶加样孔内，进行电泳（浓缩胶60 V，1小时；分离胶100 V，2小时）。当电泳即将结束时，从电泳槽上取下凝胶，将NC膜放于凝胶上方，滤纸放在NC膜上，置入转膜装置中，120 mA稳流转移2-3小时。转膜结束后，将膜置封闭液中，用封闭液1∶1 000稀释特异性兔抗人存活蛋白（survivin）抗体。将膜从封闭液中取出，置于抗体稀释液内，4℃振荡杂交过夜。用封闭液稀释酶标二抗；将膜置于稀释的酶标二抗中，室温振荡反应30-60分钟；浸入新鲜配制的显色液中，于暗处显色10-30分钟；显色完全后用大量双蒸水洗涤以终止反应。
结果
目的基因的获得
通过PCR反应，从pcDNA3.0-SVV质粒中扩增的SVV基因片段，其长度为445 bp。
重组质粒pShuttle-CMV-survivin 的鉴定
PCR鉴定
分别以重组质粒pShuttle-CMV-survivin为模板，用合成的腺病毒穿梭载体通用引物进行PCR扩增，得到大约588 bp的目的片段，产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图1。
测序鉴定
为确保重组质粒pShuttle-survivin中插入序列及读码框架的正确性，送测序鉴定，所得测序结果与GenBank报道一致。
pAd-survivin、pAd-CMV、pAd-LacZ同源重组质粒的鉴定
酶切鉴定
用PacⅠ分别酶切腺病毒骨架质粒pAd-Survivin、pAd-CMV、pAd-Lac，后者均可得到30 kb和4.5 kb两个片段。
PCR鉴定
分别以pAd-survivin、pAd-CMV、pAd-LacZ同源重组质粒为模板，用前面合成的腺病毒穿梭载体通用引物进行PCR 扩增，产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳观察大约594 bp、588 bp、143 bp、3 190 bp左右(图2)。
重组腺病毒的滴度测定
利用空斑测定法测定病毒滴度为：Ad-SVV 2.65×109pfu/ml。
树突状细胞培养及鉴定
培养第9天，倒置显微镜下可见培养细胞呈悬浮生长，胞体较大，细胞表面有树突状突起；透射电镜观察具有典型的树突状突起。用流式细胞仪检测DC表面表型为：高表达CD86、CD83、CD80和HLA-DR。
外源基因SVV蛋白表达的Western blot鉴定
通过Western blot鉴定SVV蛋白的表达，结果显示： 16.5 kD处可见一阳性条带，提示经基因转导的DC可有效表达外源基因SVV蛋白，而未转导基因的DC未检出SVV蛋白表达(图3)。
讨 论
选择合适的基因转移载体是基因成败的重要因素。腺病毒载体由于其基因组结构简单，病毒滴度高，可感染分裂和不分裂的靶细胞，对细胞的感染率高，可导入各种组织细胞，一般不会有插入突变的危险。因此，重组腺病毒已成为目前基因免疫治疗最常用的载体之一。
本实验采用的AdEasyTM XL腺病毒系统为E1、E3区缺失的复制缺陷5型腺病毒，它由于删除了E1、E3区基因，不仅使病毒不能自我复制，而且有利于外源DNA的插入。该系统中的BJ 5183 细胞含有病毒骨架质粒pAd-Easy（带有病毒的大部分基因组），该特性可显著地降低由于非重组穿梭质粒所引起的背景，使其更容易获得含有重组腺病毒质粒的克隆。在实验中为保证PCR反应的特异性，我们设计了针对目的片段的基因特异性引物，采用了高保真的Taq酶，从而大大地降低了碱基错误插入的机率，顺利获得了SVV基因片段，经测序结果分析没有发现碱基突变，使后续实验过程得以顺利进行。
本研究构建的survivin基因是一个抗凋亡基因，它全长14.47 kb，含有3个内含子和4个外显子，编码由142个氨基酸组成的相对分子质量约为16 389 D的蛋白质。它在正常成人组织中不表达，而在人类大多数肿瘤组织中表达，故可认为是肿瘤组织较为特异的基因。因此，SVV蛋白成为肿瘤较理想的靶抗原之一。Pisarev等［4］应用含有突变体survivin 的Ad载体转染DC，有效地诱导出特异免疫反应，因此该作者认为Ad是基因导入DC最有效的方法。Ad的另外优点在于它是十分重要的潜在免疫反应刺激物，能够诱导DC成熟［5-7］。一些研究也证明，表达抗原基因的病毒载体感染的DC能有效地呈递抗原，激发抗原特异性的免疫反应［8-11］。
综上所述，本研究成功制备携带SVV基因的重组腺病毒，并在DC中表达，为进一步进行抗白血病免疫治疗奠定了实验基础。
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