mPEG修饰红细胞的动物实验
作者：邱艳，檀英霞，李立立，李素波，吕秋霜，查，章扬培
【摘要】 本研究采用异硫氰酸荧光素标记鼠、猕猴、猪和人的修饰与未修饰自体和异体红细胞(RBC)并给小鼠和猕猴实施输注，观察回输体内RBC 24小时存活率的变化和差异。结果发现：未修饰小鼠RBC在小鼠体内24小时存活率为74%，2.0 mmol/L mPEG-SPA修饰的小鼠RBC在小鼠体内24小时存活率为45%，两者间有显著差异；未修饰人RBC在小鼠体内24小时存活率为8%，2.0 mmol/L mPEG-SPA修饰人RBC在小鼠体内24小时存活率为5%，两者间无显著差异。修饰的猕猴RBC自体回输后24小时的存活率大于90%，而修饰的人RBC和猪RBC在给猕猴回输后2小时其存活率已降至零。结论：RBC标记方法及不同种实验小鼠的选择对小鼠实验结果影响不大，但mPEG种类和浓度对鼠RBC寿命的有一定程度影响。用鼠RBC做自体回输来评价mPEG修饰人RBC的中mPEG是否影响人红细胞的寿命是不可靠的，修饰人RBC回输给小鼠可以作为评价修饰人RBC寿命和安全性的动物模型。大哺乳动物异种RBC输注很难观察到修饰RBC的存活率和寿命长短。适合评价修饰人RBC寿命和安全性的大动物模型有待于进一步探索。
【关键词】 mPEG-SPA； 红细胞；输血； 动物模型
Abstract This study was aimed to investigate the survival rate and difference of transfused modified and ummodified RBC at 24 hours. The modified and unmodified RBC from mice，monkey，pig and human were labeled by using FITC，then these blood RBCs were transfused to homogeneous and heterogeneous animals. The result showed that 24 hour survival rate of unmodified mice RBC transfused to mice was 74%，while survival rate of 2.0 mmol/L mPEG-SPA modified mice RBC transfused to mice was 45%，difference between them was significant. The 24 hour survived rate of unmodified human RBC transfused to mice was 8%，while 24 hours survival rate of 2.0 mmol/L mPEG-SPA modified human RBC transfused to mice was 5% without statistical difference. The 24 hour survived rate of homogeneous transfusion of modified monkey RBC was 90%，while survival rate of modified human and pig RBC was zero on 24 hours after transfusion to monkey. It is concluded that RBC labeling methods and mice species are unrelated to 24 hours survival rate，but mPEG variety and concentration are related to mouse RBC life-span. It is incredible to use mouse RBC homogeneous transfusion result instead of human RBC to evaluate longevity and safety of modified human RBC. But modified human RBC transfused to mice can be a model to evaluate longevity of modified human RBC. It is very difficult to get the result about modified RBC life span by RBC transfusion among great heterogeneous mammal animals. So evaluation in large mammal animal models needs to be further studied.
Key words mPEG-SPA ; red blood cell; transfusion blood; animal model
mPEG-SPA修饰的RBC输入体内的安全性及寿命是通用RBC研究的主要内容之一，通用RBC在未来临床的应用有着重要的意义。体内24小时存活率是评价RBC结构和功能是否正常的一个重要指标，为此我们采用小鼠和猕猴为实验模型，用异硫氰酸荧光素标记［1］鼠、猕猴、猪和人的修饰与未修饰的RBC，实施动物自体和异体输注，并检测回输体内RBC 24小时的荧光强度，来判断修饰与未修饰的RBC在小鼠和猕猴体内的存活情况，确定mPEG-SPA修饰对RBC寿命和对受者安全性的影响及探索建立评价和观察mPEG-SPA修饰的RBC在异种动物体内寿命和体内存活率的动物模型。
材料和方法
动物及RBC
实验动物昆明鼠由军事医学院实验动物中心提供，6-8周龄，雄性，共18只，其中12只为受血小鼠，6只为供血小鼠；猕猴由北京动物园提供，健康，雄性，共3只，其中1号猴重9.5 kg，2号猴重11 kg，3号猴重10.5 kg；AB型RhD(+)人的RBC由北京市红十字血液中心提供，猪的RBC由北京SPF中心提供。
试剂
华鑫生物工程公司的FITC; NECTAR的20 kD mPEG-SPA，北京BDST MAP血液保养液。
仪器
FACS Calibur(Becton Dickinson产品) 流式细胞仪，Beckman 5 diff血球计数仪。
小鼠实验
昆明鼠眼窝取血2 ml，加入280 μl CPDA血液保养液，2 500×g离心1分钟，用生理盐水洗涤3次，用2.0 mmol/L mPEG-SPA修饰，PBS（pH 7.2）悬浮细胞至45%；对照组小鼠RBC经洗涤后不修饰直接同样悬浮后，均与142 μg/ml FITC按1∶1混合，37℃水浴20分钟，标记对照组及修饰组小鼠，按上述步骤同样处理CPDA保存的人RBC。将每3只小鼠分为1组，共4组：分别为输未修饰小鼠的RBC的对照组（1），输2.0 mmol/L mPEG-SPA修饰的小鼠RBC的实验组（1），输未修饰的人RBC的对照组（2），输2.0 mmol/L mPEG-SPA修饰的人RBC 实验组（2）。通过尾静脉给每只小鼠输入0.5 ml悬浮RBC。输小鼠RBC的小鼠分别于注射后15、45、80分钟及2、3、4、20和24小时时剪尾取血，输人RBC的小鼠分别于注射后5、20、40、60分钟及2、3、4、18和24小时时剪尾取血，加入1％多聚甲醛固定。流式细胞仪测定百分数。把5分钟和15分钟后取血测定的荧光标记的RBC的百分数设为100％，之后将测定的百分数与之相比，绘制荧光标记RBC百分比曲线，24小时存活率，并与未修饰的RBC相比较。
猕猴实验
未修饰的人RBC与猴血浆的交叉配血
按10 mg/kg的剂量用吹管给猴子注射盐酸氯胺酮，将其麻醉，取猕猴血用冷吸收放散实验鉴定3只猕猴的类ABO血型，用热吸收放散法检测猕猴Rh血型，将未修饰的人RhD(+)ABRBC与3只猕猴血浆用抗人球方法进行交叉配血，同时做输血前血生化、血常规以及尿生化检查。
修饰的人RBC与猴血清的交叉配血
称取1.68g mPEG-SPA，加入36.7ml PBS（pH 8.0），配成 2.0 mmol/L mPEG-SPA，加入5 ml人RBC，25℃摇床摇晃60分钟修饰人RBC并加入MAP液保存。修饰后RBC与猴血清用抗人球方法进行交叉配血。
未修饰的猪RBC与猴血浆的交叉配血
取未修饰的猪血5-6 ml与3只猕猴血浆用抗人球方法进行交叉配血。
未修饰和修饰的猪RBC与猴血清的交叉配血
取猪RBC 5-6 ml 用PBS（pH 5.6）洗涤2次，按50 U/ml加入半乳糖苷酶进行酶解，酶解后用PBS（pH 8.0）洗涤1次，然后用生理盐水洗涤3次，与猴血清相配进行交叉配血。用1.0 mmol/L mPEG-SPA包裹酶解后猪RBC，再次与猴血清相配进行交叉配血，根据配血相容结果确定输注修饰的人和猪RBC的实验猴和对照猴。
输注血液的标记 按0.425 μg/ml称取FITC，并用PBS（pH 7.4）配成50 ml溶液，搅拌子搅拌过夜，充分溶解的FITC用滤器过滤，与修饰的人RBC、修饰的猪RBC以及对照猴自身RBC按11(v∶v)加入FITC溶液。37℃摇床反应30分钟，取出后用PBS（pH 7?4）洗涤2次，生理盐水洗涤1次，然后用生理盐水配成RBC悬液，用于输血。
血液自体异体输注
按10 mg/kg的剂量用吹管给猴子注射盐酸氯胺酮，将其麻醉，给猴子接心电监护器，记录输血前心电监护器上显示的猴的生理体征指标，自猴股静脉用注射器按4 ml/10分钟的速度给每只猴输注对应RBC各8 ml，每半小时连续记录输血后心电监护器上显示的猴的生理体征指标及观察输血后状况，回输后15、30、60、120分钟取血约50 μl，检测荧光强度，收集4小时血样进行血常规、血生化检测，收集输血后尿液进行尿生化检查。
统计学处理
采用SPSS 10.0软件对检测结果进行Chi-square检验。
结 果
小鼠实验结果
未修饰的小鼠RBC在小鼠体内24小时存活率为（82.4±2.9）%，2.0 mmol/L mPEG-SPA修饰的小鼠RBC在小鼠体内24小时存活率为（45.2±1?2）%，大约在20小时后，修饰的小鼠RBC存活率开始明显下降，两者Chi-square=23.73，df=7，P<0?001，有统计学的显著差异（图1）。未修饰的人RBC在小鼠体内24小时存活率为（7±5）%，2.0 mmol/L mPEG-SPA修饰的人RBC在小鼠体内24小时存活率为（3±2）%（P>0.05），两者无统计学显著差异（图2）。
猕猴实验结果
3只猕猴的血型均为类O型。未修饰的人RhD(+)ABRBC与3只猕猴交叉配血结果是：与1号猴和3号猴发生凝集反应，与2号猴不发生凝集反应；修饰后人RhD(+)ABRBC与3只猕猴交叉配血结果是：仅与3号猴发生凝集反应，与1号猴和2号猴不发生凝集反应（表1）。处理前猪RBC与1、2、3号猴发生凝集反应，均为强阳性，猪RBC半乳糖苷酶酶解后与1号猴和2号猴血清相配，1号猴反应为2＋，2号猴为±；包裹后猪RBC与1、2、3号猴均不发生凝集反应。给1号实验猴输注修饰的人RBC，给2号实验猴输注酶解和修饰的猪RBC，3号实验猴为对照猴（表1）。修饰的猕猴RBC自体回输后，RBC 24小时的存活率大于90%，而修饰人RBC和猪RBC在给猕猴回输后2小时其存活率已降至0，且修饰的人RBC存活率在半小时内开始迅速降低（图3）。2号和3号猴在输血前后心率、血氧饱和度、血压和体温无异常，1号猴在输血前后心率、血氧饱和度、血压无异常，但体温在输血后略有升高，输后30分钟出现轻度寒战（表2）。3只猕猴在输血后血液生化检测中总胆红素和直接胆红素比输血前有明显的升高，且实验猴比对照猴升高幅度大（表3）。3只猕猴在输血后尿液常规检查中，实验猴蛋白质含量异常，对照猴正常（表4）。3只猕猴在输血后血液常规检查中，实验猴白细胞明显增多并伴随淋巴细胞减少，而对照猴无白细胞增多只是粒细胞和淋巴细胞比例增高（表5）。Table 1. Cross-mathch of modified and unmodified pig and human RBC with monkey serum（略）Table 2. Physiological parameters in monkeys pre-and post-transfused with homo-/heterologous RBC（略）Table 3. Blood biochemistry parameters in monkeys pre-and post-transfused with homo-/heterologous RBC（略）Table 4. Urine routine tests in monkeys pre-and post-transfused with homo-/heterologous RBC（略）Table 5 . Blood routine tests in monkeys pre-and post-transfused with homo-/heterologous RBC at 4 hours（略）
讨 论
目前关于mPEG修饰的小鼠RBC自体回输后RBC存活情况研究，由于不同的研究者使用的mPEG的种类和浓度、标记方法以及实验小鼠有差别，对mPEG修饰的小鼠RBC自体回输后的存活情况还未有完全统一的结论，但是所有这些研究结果至少表明，RBC标记方法及不同种类实验小鼠的选择可能对实验结果影响不大，但mPEG种类和浓度对鼠RBC寿命有一定程度影响。对于低分子量的mPEG如5 kD C-mPEG，当浓度达到1.2 mmmol/L时，小鼠RBC寿命明显缩短；同样，高分子量的mPEG如20 kD mPEG-BTC，当浓度达到2 mmol/L时小鼠RBC寿命也明显缩短。由此可见，分子量越大，浓度越高的mPEG修饰的鼠RBC，RBC寿命明显缩短［1-6］。本研究采用20 kD mPEG-SPA修饰昆明鼠RBC，用异硫氰酸荧光素标记后自体回输，结果显示，在2.0 mmol/L的浓度时鼠RBC 24小时存活率明显低于未修饰鼠的RBC，与目前的研究结果是一致的，究其原因可能是鼠RBC体积比较小、RBC膜比较脆弱、单位面积膜与一定量mPEG结合后离心等处理，致使RBC容易破碎和溶血。因此，用鼠RBC做自体回输实验的结果来评价2.0 mmol/L 20 kD mPEG-SPA修饰Rh抗原的工艺［7］是否影响人RBC的寿命和安全性是不可靠的。
有些研究者用5 kD 5.0 mg/ml(1.0 mmol/L) C-mPEG修饰的人RBC回输给C57B1/6鼠，用细胞电泳的方式检测修饰的人RBC，发现该浓度C-mPEG对人RBC寿命无明显作用［2］；用5 kD 6.0 mg/ml(1.2 mmol/L)的C-mPEG修饰的羊RBC，PKH-26荧光素标记后给BALB/c鼠输注，发现24小时内修饰的羊RBC存活率反而高于未修饰的羊RBC，这表明mPEG修饰有利于羊RBC存活［3］；本研究采用20 kD 2.0 mmol/L mPEG-SPA修饰的人RBC，用异硫氰酸荧光素标记后给昆明鼠回输，结果也显示修饰人RBC 24小时存活率不低于未修饰的RBC。以上研究结果说明，低分子量的mPEG如5 kD C-mPEG，当浓度达到1.2 mmol/L 时，高分子量的mPEG如20 kD mPEG-BTC，当浓度达到2 mmol/L时，哺乳动物的RBC寿命均不会明显缩短。体内实验不但表明RBC经一定浓度mPEG修饰后其结构和功能正常，而且还表明回输mPEG-SPA修饰的哺乳动物RBC包括人RBC的小鼠可以作为从一个角度评价修饰的人RBC寿命和安全性的动物模型。
在大型哺乳动物实验中，王捷熙等用5 kD 3.0 mg/ml (1.0 mmol/L) C-mPEG修饰的猕猴RBC，异硫氰酸荧光素标记后给猕猴回输，修饰和未修饰的RBC半寿期均为16天［8］；本研究用20 kD 2.0 mmol/L mPEG-SPA修饰的人RBC和半乳糖苷酶酶解后mPEG-SPA修饰的猪RBC，经异硫氰酸荧光素标记后给猕猴回输，发现回输后2小时RBC存活率降至零，所有猕猴输血前后血液生化、尿液常规和血液常规检查结果表明，异种RBC在体内被迅速清除。由于种间差异大，排异反应比较大，故大型哺乳动物异种RBC输注实验很难观察到修饰的RBC的存活情况和寿命长短，因此经过免疫抑制的大型哺乳动物的是否适合作为评价修饰的人RBC寿命和安全性的动物模型还有待于进一步探索。
【】
1 李素波，贾延军，刘泽澎等. 异硫氰酸荧光素参入法测定mPEG修饰的RBC半寿期. 军事医学院院刊，2003; 27:367-369
2 Sabolovic D，Sestier C，Perrotin P，et al. Covalent binding of polyethylene glycol to the surface of red blood cells as detected and followed up by cell electrophoresis and rheological methods. Electrophoresis，2000; 21:301-306
3 Scoctt MD，Murad KL，Eaton JW. The other blood substitute: antigenically inert erythrocytes. In: Winslow RM，Vandegriff KD，Intaglietta M (Eds). Advances in Blood Substitutes: Industrial Opportunities and Medical Challenges. Boston: Birkhauser. 1997: 133-150
4 Bradley AJ，Murad KL，Regan KL，et al. Biophysical consequences of linker chemistry and polymer size on stealth erythrocytes:size dose matter. Biochim Biophys Acta，2002; 1561:147-158
5 季守平，刘泽澎，任会明等. 甲氧基聚乙二醇遮蔽红细胞表面抗原制备通用型血液的初步研究. 输血杂志，2000;13：223-227
6 Murad KL，Gosselin EJ，Eaton JW，et al. Stealth cells: prevention of major histocompatibility complex class II-mediated T-cell activation by cell surface modification. Blood，1999; 2135-2141
7 邱艳，杨海平，查岏等. Rh血型抗原化学修饰材料的选择. 中国输血杂志，2006，19（增刊）：107.
8 王捷熙，刘泽澎，曹琼等. 甲氧基聚乙二醇遮蔽猕猴RBC表面类B抗原的研究. 中国输血杂志，2003; 16：235-237
