急性移植物抗宿主病病人血清IL-2、IL-8、IL-10及TNF-α水平变化的研究
作者：王书红，达万明，靳海杰，靖域，颜光涛
【摘要】 为了探讨细胞因子IL-2、TNF-α、IL-10、IL-8在异基因造血干细胞移植后aGVHD发病中的作用，观察33例Allo-HSCT患者aGVHD的发病情况。aGVHD的诊断主要依据临床表现，部分病例还依据皮肤、肠粘膜活检的病变化。移植前后定期采集患者血清，采用放射免疫法检测细胞因子IL-2、TNF-α、IL-10、IL-8的浓度的变化。结果发现，异基因造血干细胞移植后33例患者均获得造血功能重建，13例发生aGVHD，其中8例Ⅰ度aGVHD，5例Ⅱ-Ⅳ度aGVHD。IL-2、TNF-α水平在aGVHD阳性组明显高于aGVHD阴性组，而IL-10的水平在aGVHD阳性组明显低于aGVHD阴性组，IL-8水平的变化无统计学意义。结论： 细胞因子IL-2、TNF-α在临床aGVHD的发病中起重要的正向调节作用，定期检测患者血清的IL-2、TNF-α水平有助于预测aGVHD的发生。
【关键词】 IL-2； TNF-α； IL-10； IL-8； 急性移植物抗宿主病； 异基因造血干细胞移植
Changes of IL-2，IL-8，IL-10 and TNF-α levels in Sera of Patients with Acute Graft-Versus-Host Disease
Abstract The purpose of this study was to explore the roles of cytokines IL-2，TNF-α，IL-10 and IL-8 in the pathogenesis of acute graft-versus-host disease after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. The incidence of aGVHD was observed in 33 patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. The aGVHD was clinically diagnosed. Sera from the 33 patients were taken before and after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. The IL-2，TNF-α，IL-8，IL-10 levels in serum of 33 patients were measured serially by using radioimmuno-assay(RIA). aGVHD occured in 13 patients including 8 patients with aGVHD I and 5 patients with aGVHD Ⅱ-Ⅳ. The results showed that the circulating levels of IL-2 and TNF-α were markedly elevated during aGVHD and strongly correlated with the severity of aGVHD as compared with patients without aGVHD. However，the level of the IL-10 in patients with aGVHD was significantly lower than that in patients without aGVHD. The change of IL-8 level was not significant statistically. It is concluded that IL-2 and TNF-α may play important roles in the pathogenesis of aGVHD，and measurement of serum IL-2 and TNF-α levels after allo-HSCT can provide predictive indicator for acute GVHD.
Key words IL-2; TNF-α; IL-10; IL-8; aGVHD; allo-HSCT
异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是恶性血液病和非恶性遗传性缺陷的有效手段，移植后涉及一系列移植相关并发症，如急性、慢性移植物抗宿主病、肝静脉闭塞综合症、严重感染、间质性肺炎等。其中，急性移植物抗宿主病（aGVHD）是异基因造血干细胞移植的主要并发症之一，发生率高达30%-60%，并造成约20%的移植相关死亡率，严重影响患者的生存时间和生存质量［1］。因此，aGVHD的发病机理研究是当今移植免疫的重点课题。aGVHD发生的中心环节是供者来源的T细胞识别受者的异体抗原而被激活，由于过量释放细胞因子引起受者多器官损伤的免疫病理过程［2］。本研究探讨可能引发aGVHD的细胞因子的作用，以期对aGVHD更好的早期防治提供实验依据。
材料和方法
临床资料及研究对象
以33例异基因造血干细胞移植患者作为研究对象。
所有33例病例均来自我院及307，研究时间为2002年2月至 2005年 2月，其中男性17例，女性16例，年龄 17-48岁 (中位年龄为31岁 )。33例中慢性粒细胞白血病 8例（慢性期 6例、加速期2例），急性非淋巴细胞白血病 15例，（完全缓解12例，M5原发耐药未缓解 2例，M6复发1例），骨髓增生异常综合征 4例（RA 3例、RAEB-T 1例），急性淋巴细胞白血病完全缓解3例，淋巴瘤（NHL/ALL）中枢受累1例，急性再生障碍性贫血1例，左乳低分化腺癌术后肺转移1例。
供者情况
同胞供者30例，非亲缘供者2例（慈济骨髓库），非亲缘脐血1例（山东脐血库）。
HLA配型及ABO血型
33例供受者HLA配型的结果均完全相同，ABO血型相合22例，不合11例（主要不合5例，次要不合6例）。
移植类型
24例异基因外周血干细胞移植，供者为HLA完全相合的同胞，另9例为异基因骨髓移植。
预处理方案
对白血病患者采用经典Cy+TBI： 环磷酰胺60 mg/ (kg·d)，连用2天，给美司钠拮抗出血性膀胱炎，全身照射6-10 Gy，分2天进行，肺受照剂量<8 Gy；1例急性再生障碍性贫血患者采用ATG+环磷酰胺；2例无血缘关系供者骨髓移植采用马利兰+阿糖胞苷+环磷酰胺；1例左乳低分化腺癌术后肺转移的患者采用氟达拉宾+环磷酰胺。
供者造血干细胞采集
allo-PBSCT供者应用G-CSF 300 μg/d，皮下注射，连用3天，第4天始行造血干细胞采集。干细胞均经中心静脉回输给患者。对供者为O型或者受者为AB型的次要血型不和者，回输过程中注意慢输或稀释后输。对主要血型不合者为防止移植后溶血，用羟乙基淀粉沉降并且除去移植物中的红细胞。全部患者接受全环境保护、血制品与细胞因子（G-CSF）应用及营养支持治疗。
aGVHD的诊断及预防、治疗方案
aGVHD的诊断及分级
参照美国西雅图Fred Hutchinson癌症研究中心Thomas等于1975年提出的分级诊断方法。7例患者还进行皮肤活检取得病理学证据，5例出现肠道aGVHD的患者，均经结肠镜检查及肠粘膜活检取得病理学证据。
预防方案
采用环孢霉素（CsA）以及短疗程氨甲喋呤（MTX）方案。MTX的用法为移植后1天15 mg/m2静脉滴注，移植后第 3、6、11天剂量为10 mg/m2 ； CsA用法为1.5-2 mg/ (kg·d)持续静脉滴注24小时，时间为移植前1天到移植后30天。对环孢霉素A应每周查浓度，最好根据血药浓度调整用药剂量，直至患者无严重胃肠症状后改为口服(3 mg/kg)，依据情况维持、减量。治疗aGVHD多用甲基强的松龙40 mg，2次/日，静脉滴注，好转后改口服强的松，并逐渐减量。或者用他可莫司（FK-506），剂量为0.03 mg/kg。
样品（血清标本）收集
按照静脉采血的常规，定期地采集所有allo-HSCT的患者的外周血约3 ml，离心后分离血清，所有血清标本置于1.5 ml Eppendorf管中，编号之后储存于-80℃冰箱内。采血时间分别为： ①移植前（7天左右）； ②移植后每周抽取1次外周血，连续6-12周。
细胞因子检测
本次实验采用放射免疫分析技术检测33例患者移植前后血清的细胞因子（ IL-2、TNF-α、IL-8、IL-10）的浓度，所采用的IL-2、TNF-α、IL-8、IL-10放射免疫试剂盒为人细胞因子检测试剂盒，试剂盒来自解放军总医院生物化学研究所放射免疫室（原北京东亚免疫技术研究所）。取聚苯乙烯试管编号，按放射免疫药盒加样程序操作，加入分离剂后充分混匀，室温放置20分钟，4℃ 500×g离心25分钟，吸弃上清液，在自动γ计数器上测放射性。本实验采用SN-682型放射免疫γ计数器，自动计数，结果由SN-695型 gamma计数放射免疫自动分析程序直接给出有关技术参数、标准曲线及待测样品浓度ng/ml，并由相连的机打印出结果。
植入证据
供受者性别不同，采用性染色体观察法；供受者ABO血型不同，观察血型变化；供受者性别及血型均相同，采用PCR检测DNA可变串重复序列。
统计学处理
本实验数据采用STATA计算机统计处理系统进行分析，所有数据采用均数±标准差（X±SD）表示，进行计量资料t检验。
结果
造血功能重建
33例患者异基因移植后经性染色体、ABO血型、DNA可变串重复序列检查证实，均为供者型完全植入，均获得造血功能重建。中性粒细胞恢复到0.5×109/L及血小板恢复到20×109/L的中位时间分别为移植后15（10-23）天及20（10-66）天。
aGVHD观察
33例患者中发生aGVHD共13例，其中8例Ⅰ度aGVHD，2例Ⅱ度aGVHD，3例Ⅲ度aGVHD，没有Ⅳ度aGVHD，20例未发生aGVHD。因此aGVHD发生率为39.39%，其中Ⅰ度aGVHD 8例，发生率为24.24%，Ⅱ-Ⅳ度5例，发生率为15.15%。aGVHD发生中位时间为移植后26天（11-39）。我们发现，严重的aGVHD发生早，程度较轻的aGVHD发生较晚； aGVHD患者的临床表现主要有皮疹、肝功能损害、腹泻腹痛以及发热等症状。大部分aGVHD患者经用甲基强的松龙或（和）FK-506等药物，病情得到良好控制，皮疹、肝功能损害、腹泻等症状明显减轻、好转。
预后情况
目前已知预后差的有5例： 1例CML加速期患者进行非亲缘供者（慈济）骨髓移植后116天白血病复发，因多脏器衰竭而死亡；1例慢性粒细胞白血病慢性期女性患者移植后出现超急性GVHD，第11天出现严重腹泻、腹痛，经肠镜检查为乙状结肠Ⅲ度aGVHD，治疗后曾一度好转，但终因病情较重救治无效而死亡； 2例AML-M5原发耐药未缓解及1例M6复发患者均发生aGVHD，因本病不缓解，病情重，预后差。
预后相对较好的有3例：1例AML-M2患者移植后2个月发现肺结核，经三联抗结核治疗后，发热、咳嗽症状消失，血象、骨髓象恢复正常； 1例急性再生障碍性贫血患者移植后18天开始造血重建，顺利康复；1例左乳低分化腺癌术后肺转移患者移植后肺部病变消失，复查血象、骨髓正常。病情平稳的有25例：随访2至6个月未复发。
IL-2、TNF-α、IL-10和IL-8水平的变化
结果根据aGVHD的严重程度将患者分为3组：无aGVHD组；Ⅰ度aGVHD组；Ⅱ-Ⅳ度aGVHD组。然后，比较移植前后各组的IL-2、TNF-α、IL-10、IL-8水平的变化。
IL-2水平的变化
比较各组发生aGVHD前后的IL-2水平显示： aGVHD时，Ⅱ-Ⅳ度aGVHD患者的IL-2水平(8.85±1.91)高于Ⅰ度aGVHD患者 (7?28±1.60)(P<0.05)，而Ⅰ度aGVHD患者IL-2值高于无aGVHD患者 ( 5.02±1.49)(P< 0.05)（表1）。Table 1. IL-2 level in patient serum during aGVHD（略）
TNF-α水平的变化
分析各组TNF-α水平结果显示： aGVHD时，Ⅱ-Ⅳ度aGVHD患者TNF-α(2.12±0.25) 水平高于Ⅰ度aGVHD患者 (1.46±0.41)(P<0.05)，而Ⅰ度aGVHD患者TNF-α值高于无aGVHD患者 (1.04±0.37)(P<0.05)（表2）。Table 2. TNF-α level in patients serum during aGVHD（略）
IL-8水平的变化
分析各组发生aGVHD前后的IL-8水平显示： aGVHD前后，两两比较无aGVHD患者（0.31±0.07）、Ⅰ度aGVHD患者（0.28±0?11）、Ⅱ-Ⅳ度aGVHD患者（0.32±0.12）的IL-8水平差别不大（P>0.05）（表3）。Table 3. IL-8 level in patient serum during aGVHD（略）
血清IL-10水平的变化
分析各组IL-10水平显示：移植后发生Ⅱ-Ⅳ度aGVHD患者的IL-10水平(16.32±2.64)明显低于Ⅰ度aGVHD患者 (22.73±3.63)(P<0.05)，而Ⅰ度aGVHD患者的IL-10值低于未发生aGVHD的患者(26.25±3.18) (P< 0?05)（表4）。Table 4. IL-10 level in patient serum during aGVHD（略）
讨论
放射免疫技术测定是将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法。其优点是灵敏度高，可测出ng级到pg级含量的物质，特异性强，精确性好，样品用量少，测定方法易规范化和自动化［3］。因此本研究采用放射免疫分析法检测细胞因子IL-2、TNF-α、IL-10、IL-8的浓度。检测结果提示，IL-2、TNF-α在人类aGVHD的发病中起重要的正向调节作用，Ⅱ-Ⅳ度aGVHD患者IL-2、TNF-α浓度高于Ⅰ度aGVHD患者，而Ⅰ度aGVHD患者IL-2、TNF-α值高于无aGVHD患者。而且，allo-HSCT患者发生aGVHD前1周左右，患者血清中IL-2、TNF-α浓度均明显高于移植前水平，因此我们认为，移植前、后定期(移植后每周1次，连续8周左右) 检测患者的IL-2、TNF-α水平有助于预测aGVHD的发生，并且对aGVHD严重程度的预测也有一定的作用。在用药物控制aGVHD后，IL-2、TNF-α浓度随症状的缓解而明显下降。临床上已经有成功应用IL-2受体抗体（赛尼哌）的报道［4］。动物实验证明，抗TNF-α单克隆抗体可防止aGVHD引起的肠道损害，因此可以设想注射人TNF-α的单克隆抗体是否也能降低aGVHD的发生，若有研究证实，则为今后临床应用TNF-α抗体防治aGVHD打下基础。
IL-8是一种重要的白细胞趋化因子，属于一类典型的炎症介质，对病原微生物的杀伤有促进作用。我们的实验结果尚未发现IL-8与aGVHD有相关性。
IL-10主要由 Th2细胞产生，它能有效地抑制Th1细胞和B细胞合成的细胞因子，如IL-2、TNF-α等的产生，故IL-10是典型的抑制aGVHD应答的因子［6］。我们的实验结果提示，移植前IL-10水平高的患者移植后并发症少，预后良好；IL-10的水平降低与移植后重度aGVHD的发生相关。在比较同一患者移植前后IL-10浓度时，我们发现移植后发生aGVHD患者IL-10水平明显下降，在用药物控制aGVHD后，IL-10随症状的缓解而升高; 而未发生的aGVHD的患者IL-10水平较稳定。故IL-10对aGVHD的发生起重要的负向调节作用［5］。
【】
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