用Midi MACS方法从白血病患者分选CD34＋/CD123＋细胞

                       作者：王光平，曹星玉，信红亚，李群，齐振华, 陈方平

【摘要】  本研究的目的是应用Midi MACS方法从急性髓系白血病（AML）患者骨髓细胞分选CD34+/CD123+细胞。首先，用淋巴细胞分离液从AML患者骨髓细胞分离单个核细胞（BMMNC），然后再通过Midi MACS方法相继分选出CD34＋细胞，以及从CD34+细胞中分选出CD123＋细胞并通过流式细胞术分析分选后细胞的富集度和回收率。结果显示：经过第一次分选后，CD34+细胞的富集度高达98.73%，平均为95.6%，其回收率最高可达到84.6%，平均为51%；第二次分选后，CD34+/CD123+细胞的富集度高达99.23%，平均约为83%；相对于分选前BMMNC而言，CD34+/CD123+细胞的回收率为34%，但相对于第一次分选后的CD34+细胞而言，其回收率为56%。结论： Midi MACS方法可用于AML患者骨髓CD34+/CD123+ 细胞的分选，分选后细胞的富集度和回收率与报道的通过FACS方法所获得的结果相类似。

【关键词】  CD34+/CD123+ 细胞； 分选方法； Midi MACS； 白血病

　　CD34+/CD123+  Cell Sorting from the Patients with Leukemia    by Midi MACS Method

　　AbstractThe aim of this study was to sort the CD34+/CD123+ cells from the bone marrow cells of patients with acute myeloid leukemia (AML) by Midi MACS method. Firstly, the bone marrow mononuclear cells (BMMNC) were isolated from the patients with AML with Ficoll Paque, CD34+ cells were then isolated by Midi MACS method followed by the isolation of CD34+/CD123+ cells from the fraction of CD34+ cells. The enrichment and recovery of CD34+ and CD34+/CD123+ cells were assayed by FACS technique. The results showed that the enrichment of CD34+ cells was up to 98.73%, its average enrichment was 95.6%, and the recovery of CD34+ was 84.6%， its average recovery was 51% after the first round sorting, by the second round sorting, the enrichment of CD34+/CD123+ cells was up to 99.23%, its average enrichment was 83%. With regard to BMMNCs before sorting, the recovery of CD34+/CD123+ was 34%. But, on the CD34+ cells obtained by the first round sorting，its recovery was 56%. In conclusion, these results confirmed  that the method of Midi MACS sorting can be applied to sort CD34+/CD123+ cells from  the bone marrow cells of AML patients, which give rise to the similar enrichment and recovery of the sorted cells with that of literature reported by the method of FACS.

　　Key wordsCD34+/CD123+ cell； sorting  method；  Midi MACS; leukemia

　　白血病，尤其是急性髓系白血病（AML），是起源于少量的干/祖细胞疾病。这些干/祖细胞是一些发生了突变的造血干/祖细胞，即白血病干/祖细胞（LSPC）［1，2］。除了具有正常造血干细胞（HSC）的自我更新和某些细胞表型如CD34+、CD38-、CD71-以及HLA-DR-等特征外，LSPC还具有自己特有的表型，即CD90-、CD117-、CD123+［3-5］。因此，依据这些特异性的表型，可对LSPC进行分离和纯化。在分离正常造血干/祖细胞（HSPC）中，MACS分选方法得到了广泛的应用。但是，采用该方法分选LSPC的报道却很少。为此，本研究应用Midi MACS分选方法对AML患者的CD34+/CD123+双阳性细胞进行了分选。

　　材料和方法

　　单个核细胞的分离

　　无菌抽取AML患者（2例M2a，1例M1）3-6 ml骨髓，放于加有肝素的15 ml试管内，用等体积无钙离子的PBS缓冲液（Gibco产品）洗涤和稀释后，慢慢加到含有淋巴细胞分离液（购于北京鼎国公司）的试管内，于室温350×g离心20分钟。离心后，小心除去上清液并吸取白细胞层于另一新试管内，首先用5 ml 无钙离子PBS+2 mmol/L EDTA缓冲液（以下简称为缓冲液1）洗涤细胞，于130×g离心5分钟。然后，用5 ml缓冲液1重悬细胞并于90×g离心2次，每次5分钟。离心后，再用2 ml的缓冲液1重悬细胞并计数细胞。经60×g离心5分钟后，按每108个细胞用300 μl的比例加入无钙离子的PBS+2 mmol/L EDTA+0.5%  FCS缓冲液（以下简称为缓冲液2）重悬细胞。

　　CD34+细胞的分选

　　首先用CD34多分选试剂盒（Miltenyi Biotec公司产品）分选CD34+细胞，亦即取已混匀好的封闭试剂100 μl加入到300 μl的上述细胞悬液中,混匀后置室温5分钟。然后，每108个细胞加入100 μl的CD34磁珠（小于108个细胞，仍加入100 μl的CD34磁珠），轻轻混匀后，于4℃作用30分钟。用5 ml缓冲液2重悬细胞，于90×g离心2×5分钟后，再用5 ml缓冲液2重悬细胞。将Midi分选柱子（Miltenyi Biotec公司产品）安装在分选器上，过柱分选之前，先用3 ml缓冲液2过柱以润湿柱子。然后，将上述已标记好的细胞悬液加到柱子上并经4×5 ml缓冲液2过柱洗涤。洗涤后，将分选柱子从分选器上撤离下来并置于另一新的15 ml试管上，用5 ml缓冲液2通过加压的方式洗脱阳性细胞，离心、计数细胞后留取适当数量的细胞用于流式细胞术分析。

　　CD34+/CD123+ 双阳性细胞的分选

　　为分选CD34+/CD123+ 细胞，首先需除去细胞上已结合的磁珠。其方法是，每毫升上述细胞悬液加入20 μl的磁珠除去试剂，于4℃作用30分钟。待反应结束后，再用3×3 ml缓冲液2，按上述方法过柱洗涤。不同的是，此时应收集通过柱子的细胞。将细胞悬液离心后，每107个细胞用50 μl缓冲液2重悬细胞（小于107个细胞仍用50 μl的缓冲液）以及每107个细胞加入30 μl的终止液。然后，在上述细胞悬液中加入80 μl的缓冲液2，混匀后再加入20 μl的抗-CD123-PE抗体（Miltenyi Biotec公司产品）于上述细胞悬液中并混匀，于4℃作用30分钟。 用2×2 ml的缓冲液2洗涤细胞，  200×g离心10分钟，并按每107个细胞加入80 μl的比例加入缓冲液2，重悬细胞后再每107个细胞加入20 μl的抗PE-磁珠（Miltenyi Biotec公司产品），于4℃作用30分钟。用缓冲液2洗涤细胞2次， 90×g离心5分钟。最后，每108个细胞用500 μl缓冲液2重悬细胞，用于再次分选，过柱分选方法同前。 过柱后，计数细胞并留取适当数量的细胞用于流式细胞术分析。

　　流式细胞术分析

　　分别取2×105个分选前后的细胞放于一试管内，用PBS缓冲液洗涤2次。经350×g离心10分钟后，除去上清液并将细胞重悬于500 μl的PBS缓冲液中。混匀后，取250 μl的细胞悬液于另一试管内，并将各管分别标记为阴性和阳性。在阳性管内加入15 μl的CD34-FITC抗体（PharMingen公司产品），而在阴性管内分别加入15 μl的鼠IgG1-FITC和（或）鼠IgG1-PE即在CD34-N试管内加入鼠 IgG1-FITC抗体，而在CD34-N/CD123-N试管内加入鼠 IgG1-FITC和鼠IgG1-PE抗体标记细胞作为阴性对照。室温避光作用30分钟后，加入1 ml的PBS缓冲液，于350×g离心10分钟，除去上清液并加入约500 μl的PBS缓冲液重悬细胞，上机分析。由于在CD34+/CD123+ 双阳性细胞分选的过程中，细胞已用抗-CD123-PE抗体进行了标记，因此在进行流式细胞术分析时不需再另外加入抗-CD123-PE抗体。

　　结果

　　用抗CD34磁珠第一次分选CD34+细胞后，CD34+细胞的富集度高达98.73%（附图1-4），平均为95.6%，回收率最高可达到84.6%，平均为51%。第二次分选后，CD34+/CD123+细胞的富集度可高达99.23%（附图5-8），平均约为83%。 相对于分选前单个核细胞而言，CD34+/CD123+细胞的回收率为34%，但相对于第一次分选后的CD34+细胞而言，其回收率为56%，与第一次分离的CD34+细胞的回收率相似。

　　讨论

　　根据细胞表面分化抗原表达的差异，当前常常采用两种方法来分选目的细胞，即应用流式细胞仪的FACS和通过吸附单克隆抗体-磁珠系统的MACS分选方法。FACS方法分离后得到的细胞的纯度很高，但该方法需要昂贵的流式细胞仪并且操作复杂。相反，MACS系统分选法所需仪器简单，操作容易。同时，通过MACS系统分离的细胞也可以获得很高的纯度和回收率，如本研究所分离的CD34+和CD34+/CD123+细胞的富集度分别可达98%和99%，不低于通过FACS分选所得的LSC细胞［6］。另外，MACS分选系统使用的磁珠极小，其直径仅为30-60 nm，约为一个淋巴细胞的千分之一，并不影响分选后目的细胞的功能，分选后的细胞仍可用于后续的细胞培养和功能研究。由于在AML患者CD34+部分细胞内表达CD123的细胞在99%以上，而在正常人CD34+部分细胞内表达CD123的细胞非常低。同时，将AML患者的CD34+/CD123+细胞移植给NOD/SCID小鼠可形成白血病。因此，CD123被认为是人类AML干细胞特有的标志［5］。另外，正常骨髓CD34+细胞的含量很低，仅为骨髓有核细胞的1%，而本研究所选择的AML病例其CD34+细胞和该部分细胞内表达CD123的细胞也很高（如附图中的2和6），因此本研究从AML患者骨髓分选到高富集度的CD34+/CD123+细胞，其绝大多数细胞应是LSPC。本研究应用MACS分选系统成功分选到高富集度的CD34+/CD123+细胞，这也为利用该方法分选其它实体瘤起始细胞提供了实验基础。为获得高纯度和高回收率的CD34+/CD123+细胞特别是高比例的CD34+/CD123+的LSPC以保证后续其它实验有足够数量高纯度的细胞，应选择外周血白细胞数、白血病幼稚细胞特别是CD34+/CD123+细胞含量较高的病例。为此，本研究通常是在分选前测定患者骨髓CD34+/CD123+细胞的含量之后，再进行分选。另外，由于白血病患者血液样本的特殊性，在分离单个核细胞时，最好用无钙离子的PBS缓冲液多次洗涤样本，并且在分离之前对样本进行稀释。另外，用加有2 mmol/L EDTA和0?5% FCS的PBS缓冲液也可以防止细胞聚集成团块、黏附于试管以及减少过柱时的损失。

【】
  　　1 Lapidot T, Sirard C, Vormoor J, et al. A cell initiating human acute myeloid leukemia after transplantation into SCID mice. Nature, 1994; 367(6464):645-648

　　2 Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med, 1997; 3:730-737

　　3 Blair A, Hogge DE, Ailles LE, et al. Lack of expression of Thy-1(CD90) on acute myeloid leukemia cells with long-term proliferative ability in vitro and in vivo. Blood, 1997, 89:3104-3112

　　4 Blair A, Sutherland HJ. Primitive acute myeloid leukemia cells with long-term proliferative ability in vitro and in vivo lack surface expression of c-kit(CD117). Exp Hematol, 2000; 28:660-671

　　5 Jordan CT, Upchurch D, Szilvassy SJ, et al. The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myeloid leukemia stem cells. Leukemia, 2000; 14:1777-1784

　　6 Guzman ML, Neering SJ, Upchurch D, et al. Nuclear factor-kappaB is constitutively activated in primitive human acute myelogenous leukemia cells. Blood, 2001; 98:2031-2307.