人类ERMAP基因在不同胎龄胎儿组织中表达的研究
作者：何新荣，何映谊，陈滢，叶铁真
【摘要】 人类ERMAP基因是新近发现的编码红细胞膜相关蛋白基因，其功能可能与红系造血活动有关。为探讨该基因在胎儿造血过程中的作用，收集9-36周难免流产胎儿共29例，分别抽提其肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肺脏、胸腺、大脑、骨髓和肌肉等9种脏器组织的RNA，取其中胎龄25+5周（25周过5天，下同）的胎儿各脏器组织的RNA进行Northern blot检测，了解人类ERMAP基因在胎儿脏器组织中的表达谱，同时采用荧光定量PCR（FQ-PCR）方法观察该基因在不同胎龄胎儿组织中表达量的变化。结果Northern blot检测显示，人类ERMAP基因在25+5周胎儿肝脏和骨髓中表达阳性，而在脾脏、肾脏、胸腺、心脏、肺脏、大脑及肌肉中表达阴性。FQ-PCR结果显示，人类ERMAP基因在9-36周胎儿肝脏中均有表达，其表达量从第12周开始升高，18-20周达高峰，21周后逐渐下降；该基因在胎儿骨髓中的表达则从15周开始，27-32周达高峰，之后迅速下降，其表达量低于肝脏；在其余7个脏器中仅有部分标本呈现低水平表达。结论：人类ERMAP基因在胎儿肝脏中的表达规律与胎儿肝脏造血过程基本一致，在15-32周胎儿骨髓中的表达规律与胎儿期骨髓造血活动基本吻合，推测该基因的功能可能与胎儿发育过程中红系细胞向肝脏和骨髓的迁移活动有关。
【关键词】 ERMAP基因；胎儿期；肝脏；骨髓；造血
Expression of Human ERMAP Gene in Fetal Tissues
AbstractHuman ERMAP (hERMAP) is a novel gene coding for erythroid membrane-associated protein, which may play a role in erythropoiesis. To explore the role of hERMAP in fetal hematopoiesis, 29 fetuses of inevitable abortion with the fetal ages of9-36 weeks were collected, and the total RNAs were isolated from the liver, spleen, kidney, heart, lung, thymus, brain, bone marrow and skeletal muscle, the RNAs from which at 25+5 week fetal age were used to detect hERMAP expressions in different fetal tissues with Northern blot, and the hERMAP in various fetal tissues were quantified by FQ-PCR. As a result, Northern blot showed that hERMAP was expressed in liver and bone marrow at 25+5 fetal age, but not in the other organ tissues. FQ-PCR results indicated that the hERMAP had been still expressed in 9-36th week fetal liver, increased starting from 12th-week, reaching a peak between 18 -20th week and declining slowly starting from 21st-week. In the fetal bone marrow, expression of the hERMAP began from 15th week, reached a highest level between 27-32nd week and fell rapidly from 33rd week, the expression level of which was lower than that in liver. The low level expression of this gene was observed in some specimens of kidney, heart, lung, thymus, brain and skeletal muscle. It is concluded that the expression of hERMAP in fetal liver approximately consistent with haematopoiesis of fetal liver, and the expression of this gene in bone marrow aged 15-32th fetal weeks coincides with haematopoiesis of fetal bone marrow. It suggests that the function of the hERMAP is possibly related with the migration of erythroid cells to liver and bone marrow during the fetal development process.
Key words human ERMAP；fetal stage；haematopoiesis
近年来，Ye等［1-3］分别从鼠胚胎红细胞和人胎肝cDNA文库中筛选出编码红细胞膜相关蛋白（erythroid membrane-associated protein，ERMAP）基因，并证实其高度特异表达于胎肝、成人骨髓等造血组织以及K562和HEL细胞系，其编码的蛋白分子定位于网织红细胞和原始红细胞膜、293T细胞膜和其他胞浆小体上，分析显示其为一跨膜蛋白分子，属免疫球蛋白超家族成员。推测ERMAP可能通过细胞间的黏附和（或）识别，影响红系造血，或在红系相关性疾病、 自身免疫性疾病和其他疾病中起一定
作用。 目前关于该基因的特性与功能尚待进一步研究。本研究旨在通过观察人类ERMAP基因在不同胎龄胎儿各脏器组织中的表达谱及表达量的变化，探讨该基因在胎儿造血过程中的作用。
材料和方法
材料
收集2004年3月至2004年11月由广东省妇幼保健院、广州医学院第二附属、东山区妇幼保健院、海珠区妇幼保健院等医院妇产科提供的难免流产胎儿，胎龄不限。均排除胎儿先天畸形、孕母遗传性疾病、妊娠期间用药史。胎儿离开母体后立即取肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肺脏、胸腺、大脑、骨髓和肌肉9种脏器组织，放入冻存管，置于-80℃冰箱保存。
方法
总RNA的提取称取50-100 mg组织置于研钵中，加入液氮研磨成粉末状，转移至含1 ml RNA-solv的离心管中，按照RNA-sol试剂（Omega公司产品）说明书提取RNA，置于-80℃保存。用紫外透射灯(Amersham公司产品)分析其纯度，要求OD260/OD280值在1.8-2.0。提取物经1%琼脂糖凝胶电泳证实为完整RNA。
ERMAP基因表达谱的Northern blot观察选取1个胎龄为25+5周(25周过5天）的胎儿，将上述9种脏器组织的总RNA在1%琼脂糖凝胶上甲醛变性电泳3小时（5 V/cm），在紫外分光光度仪下测量18S、28S条带到点样孔的距离，利用真空转移仪转膜2小时。然后以PCR方法分别标记ERMAP和β-actin探针（按照PCR DIG Probe Synthesis Kit试剂盒说明书操作，引物由北京赛白盛有限公司合成），ERMAP引物序列为5′-GAGATGGCGAGTTC TGCT-3′ ，5′-CACCGTCCTCCCCTTATA-3′ ，β-actin引物序列为5′ -CATCTCTTGCTCGAAGTCCA -3′，5′ -ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′。对照管加入无DIG标记的dNTPs。探针变性后进行预杂交及杂交，经过低严谨性和高严谨性洗膜后，加入Anti-Digoxigenin-AP孵育30分钟，再加入CDP-Star显色剂于尼龙膜上，将膜曝露在化学发光成像仪（美国System-genome公司产品）中检测荧光信号。
ERMAP基因表达量的FQ-PCR检测［5］取各脏器组织的总RNA逆转录制备cDNA（反应体系参照Promega公司试剂说明）。将已测定浓度的含有ERMAP基因cDNA序列的pBluescriptSK+质粒（加拿大McMaster大学病理与分子医学系Dr. David Chui教授赠送）依次10倍稀释成7个浓度级梯度作为模板，用于建立标准曲线。取同一样品的等量cDNA作为PCR模板，分别加入ERMAP及β-actin的引物、探针以及TaqMan Universal PCR MasterMix（美国ABI公司产品），检测ERMAP及β-actin的表达水平，两者之比即为ERMAP在各组织中的相对表达量。ERMAP和β-actin引物与 MGB探针由上海基康有限公司合成，序列如下：ERMAP primer1：5′-CATGTGACGGAGGTGG ACAA-3′ ERMAP primer2：5′ -CAGCTTTATGGAGTTT TCCTTTTTCT-3′ ERMAP MGB probe：FAM-CTTCTTTCAGACC ATGCTA-MGBβ-actin primer1：5′-ACGGCCAGGTCATCAC CAT-3′ β-actin primer2：5′-AAGGCTGGAAGAGTGCC TCAG-3′。β-actin MGB probe：FAM-CAATGAGCGGTTC CG-MGB。
统计学处理
基因的相对表达量以±SD表示，采用Origin Pro 7.5软件进行资料分析和绘图。
结果
人类ERMAP基因在胎儿脏器组织中的表达谱
Northern blot显示肝脏和骨髓表达阳性，而脾脏、肾脏、胸腺、心脏、肺脏、大脑及肌肉等表达阴性（图1）。
胎肝组织RNA以ERMAP探针杂交后，其阳性条带到点样孔距离为4.04 cm，推算出目的基因的mRNA长度为3.6 kb，与人类ERMAP mRNA长度一致。
人类ERMAP基因在不同胎龄胎儿组织中表达量的变化
FQ-PCR标准曲线将已测定浓度的含有ERMAP基因cDNA的质粒pBluescriptSK+依次10倍稀释成108-102 cps/μl等7个浓度梯度，经FQ-PCR后获得典型的倒“S”型曲线，可检测到荧光信号的起始循环数（Ct）与模板浓度对数值的相关函数为У=－3.557Ct+38.152，r2=0.998178。
人类ERMAP基因在胎儿肝脏和骨髓中的表达量ERMAP基因在9-36周胎儿肝脏中均有表达，其表达量从第12周开始升高，18-20周达高峰，21周后逐渐下降。ERMAP基因在胎儿骨髓中的表达则从15周开始，27-32周达高峰，之后迅速下降，各阶段的表达量均低于肝脏（附表，图2）。Table. Expression of ERMAP in fetal liver and bone marrow at different fetal ages（略）
人类ERMAP基因在胎儿其它脏器中的表达量检测脾脏、肾脏、心脏、肺脏、胸腺、大脑及肌肉7种脏器各17个标本，结果显示ERMAP基因仅在部分标本中低水平表达，其表达的阳性率（即各脏器阳性例数与总例数之比）分别为20%、7.6%、25%、13%、20%、7.6%和25%。
讨论
人类胚胎期造血经历了卵黄囊造血、肝脾造血和骨髓造血等造血部位的迁移过程。卵黄囊造血始于妊娠第3周，终止于第8周。在妊娠第5周肝脏发育成完善的血窦系统，造血干细胞（hemotopoietic stem cells，HSC）随血流迁移并种植于肝脏，进入了胎肝造血期。随着胚胎的不断发育，胎肝来源的HSC不断迁移至骨髓血管外基质，在骨髓腔中分化成熟，形成骨髓造血。骨髓造血一直持续至出生后，成为终身的造血器官。除了迁移至骨髓外，胎肝的HSC还可迁移、定植于脾脏、胸腺和淋巴结，并在其中开始造血活动。在整个胚胎造血过程中，各器官的造血活动是连续不断、此消彼长的。但是期间的调控机理如何，至今尚未阐明。越来越多的研究表明，某一器官的造血能力主要取决于其造血微环境，当一个器官的微环境不再适合造血活动时，其中的造血干细胞便随血液流向其它组织，与其中的成分相互作用，从而启动造血细胞的增殖与分化，最后形成新的造血中心［4］。造血细胞的迁移和定植是由造血细胞表面的一系列黏附分子与造血微环境中相应的配体结合后所引起的信号转导的结果［6］，这种黏附分子与相应配体相互作用，在造血细胞增殖和分化过程中同样发挥着重要的调节作用。造血微环境中的黏附分子及其配体，与细胞外基质、细胞因子、转录因子等共同形成造血调控的分子基础。红系造血细胞发育过程的不同阶段，其细胞膜表面的黏附分子的表达呈现一定的时空［7］。hERMAP基因编码红细胞跨膜蛋白，为一黏附分子，属免疫球蛋白超家族成员。Xu等［3］证实，hERMAP基因表达于第12周和23周的胎肝红细胞、成人骨髓，以及第8-12周脐带血中的网织红细胞和原始红细胞，提示该基因在胚胎红系造血中可能起到一定的作用。但Xu的研究仅为定性研究，且未对该基因在胚胎脏器中的表达量作连续动态观察。本研究在本课题组建立的hERMAP基因FQ-PCR检测方法的基础上［5］，对hERMAP基因在不同胎龄器官组织中的表达量进行动态观察。结果显示，该基因在妊娠9-36周胎儿肝脏中均有表达，其表达规律与胎儿肝脏造血过程基本一致。该基因在胎儿骨髓中的表达则始于15周，30-32周达高峰，这与胎儿期骨髓造血活动基本吻合，但妊娠32周后骨髓造血活动仍然存，而hERMAP基因的表达却迅速下降。由附表和图2可见，在妊娠15-17周，hERMAP在胎肝的表达量出现较为明显的下降，我们认为这可能与粒系细胞的生成有关。早期胎肝所产生的几乎全部是幼稚红细胞，妊娠3-4个月胎儿红细胞约为109/L，妊娠4个月左右胎肝开始有明显的粒细胞生成。而在此阶段，胎肝所生成的红细胞数量并无明显的增加。由于本研究的检测结果是以hERMAP与β-actin的表达量之比表示的，反映的是hERMAP在各组织中的相对表达量。因此，在妊娠15-17周，hERMAP在胎肝的相对表达量下降，之后胎肝造血进入旺盛阶段，红系造血明显活跃，红细胞数量可达1011/L，hERMAP的表达量出现高峰，直到21周后随着肝脏造血活动减弱而逐渐下降［8］。由上述结果推测，人类ERMAP基因的功能可能与胎儿发育过程中红系细胞向肝脏和骨髓的迁移活动有关，在肝脏造血后期以及妊娠后期，大量造血细胞向肝脏和骨髓的迁移活动基本完成，其基质内的ERMAP配体数量下降，ERMAP基因的表达水平也随之下降；但ERMAP蛋白与其配体作用的机制如何，其是否参与了胚胎红系造血细胞增殖和分化的调控，仍有待下进一步的研究证实。研究结果还显示，该基因在胎儿脾脏、肾脏、心脏、肺脏、胸腺、大脑及肌肉等脏器组织中的表达水平较低或不恒定。取胎龄25+5周的胎儿脏器进行Northern blot检测也同样证实了该基因主要表达于胎肝及骨髓组织，而在其它脏器组织中表达阴性，推测可能与下列因素有关：①在胚胎造血过程中，虽然卵黄囊、胎肝或骨髓的HSC可迁移、定植于脾脏、胸腺，但其产生的造血细胞数量远不如胎肝和骨髓［9］，所以ERMAP基因的表达量较低；②肾脏、心脏、肺脏、大脑及肌肉不是造血器官，缺乏ERMAP的特异性配体，但由于胎儿血液中含有一定数量的HSC，在这些器官或组织中亦可以检测到ERMAP的低水平表达，但并不恒定。遗憾的是，由于取材条件所限，本研究未能观察到hERMAP在妊娠9周以前以及36周以后的表达情况，因此未能对胚胎发育全过程的ERMAP基因表达规律作更全面的动态研究。
【】
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