回输的血小板在体内清除机制研究进展
【摘要】 生，病理学方面的研究发现血小板在体内清除主要发生在肝脏和脾脏，但衰老和损伤的血小板被体内清除系统识别和清除的机制还并不清楚。这一机制研究的深入将有助于解决血小板低温保存后体内存活期短，不能较长期发挥作用的难题，为血小板保存提出新的策略。本文就血小板回输体内后的清除机制，包括P-选择蛋白，GPⅠbα及其受体Mac-1和内源性金属蛋白酶在血小板清除进程中的作用等的研究进展作一综述。
【关键词】 血小板；血小板保存；清除机制；P-选择蛋白；GPⅠbα；内源性金属蛋白酶
Advances in the Studies of the Clearance Mechanism of Transfused Platelet Concentrates——Review
AbstractPlatelet clearance has already been studied in physiological and pathological conditions and shown its occurrence mainly in the liver and the spleen. It is still not clear what mechanisms are responsible for recognition and removal of either aged or damaged platelets by the scavenging system. So study of the clearance mechanism will be useful to prolong the survival time of plateletes in vivo. And it may be related to a new strategy to store platelets. This article focuses on the advances in studies of the clearance mechanism of transfused platelet concentrates, including roles of P-selectin, GPⅠbα and its rectptor Mac-1 in platelet clearance, and effect of endogenous metalloproteinase in platelet clea- rance.
Key wordsplatelet; platelet preservation; clearance mechanism;P-selectin; GPⅠbα; endogenous metalloproteinase
血小板制品在临床输血中具有重要作用，在大量失血和化疗、放疗等处理后造成的血小板减少症患者的治疗过程中，需要进行血小板输注［1］。因此，保证足够的血小板贮备和供应显得尤为重要。目前临床常规用血小板保存方式有以下两种：①常温（22±2℃）连续振荡条件下保存5天，利用此方法保存的血小板易受到细菌的污染，输注污染血小板可能造成严重输血反应，甚至致死，现己成为输血安全的重大问题。另外由于常温保存期短，不能满足血小板临床需求量的迅速增加［2］。②冰冻保存血小板，虽可以大大延长血小板的保存时间达3年，但是临床资料表明，血小板输入体内的存活期非常短，其原因可能是血小板在冰冻过程中活化后被体内的免疫系统所清除,目前对该清除机制还没有研究清楚。近年来研究者们对血小板体内清除机制进行了大量研究，发现GPⅠbα、P-选择蛋白以及金属蛋白酶等在血小板体内清除中起重要作用。这些发现将有助于解决血小板保存的难题，为血小板保存提出新策略。本文对血小板回输体内后的清除机制的研究进展作如下综述。
P-选择蛋白在血小板清除过程中的作用
P-选择蛋白亦称α颗粒膜糖蛋白140（GMP-140）或CD62p，表达在静息血小板α颗粒膜上［3］。当血小板活化时，α颗粒膜迅速与质膜融合，P-选择蛋白暴露于血小板表面，这一特征已使P-选择蛋白成为血小板活化的标志。另外，P-选择蛋白亦表达在内皮细胞的Weibel-Palade小体上。P-选择蛋白介导血小板、内皮细胞与中性粒细胞、单核细胞之间的相互作用［4-7］，后两者通过其P-选择蛋白糖蛋白配体-1（PSGL-1）与P-选择蛋白相互作用。因此，研究者提出P-选择蛋白可能参与介导血小板清除。早在20世纪80年代末， 研究者就已发现P-选择蛋白是血小板与白细胞结合的黏附受体，推测P-选择蛋白可能是血小板体内清除的调节子［8］。随后，Rinder 等［8］和Triuliz等［9］相继报道了P-选择蛋白暴露与血小板输注后0.25至1小时内存活率和功能存在着负相关关系，但他们仅研究了血小板回输后早期的清除过程，即血小板输注后1小时内的清除，并非长时间的清除过程。1996年Michelson等［10］用灵长类动物狒狒进行动物实验得出了不同结论，对狒狒输注凝血酶活化的血小板后，发现凝血酶活化的血小板表面暴露的P-选择蛋白快速水解丢失至血浆，但并未显著改变血小板在体内的存活时间和功能。因此Michelson认为，对于凝血酶活化的血小板，P-选择蛋白表达并不影响血小板在体内的存活时间。1998年Berger等［11］进一步验证了Michelson的结果，利用P-选择蛋白缺陷小鼠和体内血小板生物素标记技术，通过回输衰老的或低温损伤（4℃非可逆损伤）的血小板，发现血小板在野生型和P-选择蛋白缺陷的小鼠体内的存活时间并无差异。因此，进一步验证了P-选择蛋白在衰老的或低温损伤的血小板清除过程中不起作用。同时，还发现血小板表面的P-选择蛋白被快速水解，产生100 kD大小的可溶性P-选择蛋白片段，从而发挥其生物学作用，如参与白细胞募集和血栓形成等。上述研究，无论是体外凝血酶活化的、衰老的，还是低温损伤的血小板，回输体内后其表面的P-选择蛋白都被快速水解，不改变血小板在体内的存活时间。因此Michelson认为，血小板表面的P-选择蛋白表达与血小板清除无关。最近，Leytin等［12］提出一种新的观点，即血小板体内清除具有双时相性。他们运用网状内皮系统抑制的兔作为动物模型，通过流式细胞术检测抗P-选择蛋白和抗GPⅠbα来测定血小板的体外活化作用，分别测量回输后0.5小时、24小时以及24小时内血小板的恢复状况和存活时间，并分析体外血小板活化与体内清除关系，即分析VIT-VIV相关性。 Leytin等人还发现不管是新鲜的（22℃，2-5天）、衰老的（22℃，7-8天），还是冷藏的（4℃，1-4天）血小板体内存活曲线都是双时相曲线（biphasic survival curve），血小板清除根据体内存留的时间分为：清除早期［first（early）phase］和清除延迟期［second（delayed）phase］。研究发现，血小板回输体内0.5小时内（first phase）体内清除率为35％，随后24小时内（second phase）清除率又增加49％。抗P-选择蛋白与衰老的和冷藏损伤的血小板结合率比与新鲜血小板结合率明显增加、而抗GPⅠbα结合率减少。另外还发现0.5小时内血小板回收率与表面的P-选择蛋白密度呈负相关，P-选择蛋白回输体内后被快速清除，这与回输凝血酶活化的血小板结果一致［10，11，13］。相反，血小板表面抗GPⅠbα的结合率与血小板延迟清除呈正相关。由此Leytin等认为，血小板回输后P-选择蛋白，介导了血小板体内的早期清除（1小时内），而GPⅠbα的水解、簇集或构象等改变介导了血小板体内的延迟清除（24小时内）。可见P-选择蛋白和GPⅠbα可能都参与血小板体内清除，只是它们发挥作用的时间不同。 P-选择蛋白介导血小板的早期清除，而GPⅠbα介导血小板的延迟清除。然而，这些研究结果还需要进一步的临床验证。
GPⅠbα及其受体Mac-1在血小板清除过程中的作用GPⅠb（分子量约为165 kD）是血小板膜表面含量最丰富的糖蛋白之一，由GPⅠbα（CD42b，分子量140 kD）和GPⅠbβ（CD42c，分子量25 kD）以二硫键相连而成，GPⅠbα，GPⅠbβ，GPⅨ和GPⅤ以2∶2∶2∶1的比例形成复合物GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ。GPⅠbα是von Willebrand因子（vWF）和凝血酶的受体，起着维持血小板黏附和聚集等功能，是另一个血小板活化标志［14，15］。vWF因子与GPⅠbα结合依靠vWF因子上一个特定片段—A1结构域，这一结构域存在于包括整合蛋白Mac-1在内的多种黏附分子中，故GPⅠbα亦是白细胞整合蛋白Mac-1（αmβ2，CD11b/CD18,CR3）的识别位点。Mac-1是单核/巨噬细胞膜上的主要整合蛋白，主要介导吞噬作用。可与多种受体结合，如iC3b，细胞黏附分子ICAM-1等。虽然GPⅠbα与vWF和Mac-1的结合均通过同源A1结构域，结合部位均在GPⅠbα的胞外氨基末端区，但二者的结合位点不同［6，16］。早期研究发现GPⅠbα通过与白细胞Mac-1受体［6，7］、vWF因子以及活化的内皮细胞表面的P-选择蛋白［5，17］结合，来参与血小板的清除。Hoffmeister等［6］发现，血小板表面的GPⅠbα与单核/巨噬细胞膜上的Mac-1相互作用导致冷藏处理的血小板清除。当血小板暴露于低于15℃时，血小板发生形态改变，长期以来人们认为这是引起血小板被加速清除的主要因素。但是，Hoffmeister等［18］却惊奇地发现，尽管用Ca2＋ 螯合剂（EGTA-AM）和细胞松弛素B可以维持低温处理的血小板膜的完整性，但低温处理血小板输入体内后同样会被很快清除［6］。因此，血小板形态改变不是导致低温处理血小板被清除的重要因素［19，20］。研究发现，在常温条件下GPⅠbα受体在血小板膜上呈分散分布，故与单核/巨噬细胞膜上的Mac-1亲合力低，不能导致血小板被吞噬破坏［7］。血小板冰浴2小时后，导致血小板表面的GPⅠbα簇集。暴露GPⅠbα N-链聚糖的β-N-乙酰葡萄糖氨基残基（β-N-GlcNAc）［7］，被肝巨噬细胞Mac-1受体识别，导致血小板被清除［6，7］。由此可推测，血小板上GPⅠbα作为重要成员参与此现象。另外低温处理的鼠血小板被肝Kuffer细胞（窦状巨噬细胞）所清除，但在Mac-1缺陷的小鼠体内清除速度与室温保存的血小板清除速度相同（即将低温处理的血小板输入Mac-1缺陷的小鼠体内，其寿命及止血功能均正常），因此，整合蛋白Mac-1也在低温处理的血小板清除过程中起重要作用。事实上，鼠血小板表面的GPⅠbα蛋白的水解阻止了低温处理后血小板的清除。同样地，蛇毒金属蛋白酶（mocarhagim）选择性水解低温诱导暴露的血小板GPⅠbα，阻止THP-1细胞表面Mac-1依赖的吞噬作用［6］。Hoffmeister等［6］通过免疫金定位实验，发现低温导致鼠血小板表面GPⅠbα不可逆地簇集，从而增加Mac-1的识别，但这是否直接增加Mac-1识别还需进一步证实［20］。Leytin等［12］通过体外抗GPⅠbα血小板表面结合率与血小板体内回输率，以及血小板体内存活曲线的相关性分析，进一步验证了GPⅠbα在血小板体内清除的作用，并提出不管GPⅠbα被水解［21］还是重排［6，7］其主要在血小板的延迟清除［second（delayed）phase］中发挥作用。
内源性金属蛋白酶在血小板清除过程中的作用目前发现人血小板中含有4种内源性金属蛋白酶，即MMP-1，MMP-2，MMP-3和MMP-9。这些金属蛋白酶以非活化形式存在于静息的人血小板内，当其转位到血小板表面时，通过蛋白水解激活其酶活性，从而发挥多种生物学作用。MMP-1和MMP-2参与血小板粘附和聚集，而MMP-9则抑制血小板活化。最近Bergmeier等［21］用碳酰氰基-对-氯苯腙（carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP）37℃过夜孵育血小板建立线粒体损伤模型以模拟血小板保存损伤，从而证明了内源性金属蛋白酶在血小板清除中起重要作用。研究发现金属蛋白酶可水解血小板表面的GPⅠbα，而抑制金属蛋白酶作用则显著提高线粒体损伤和衰老的血小板的回收率，同时阻止了GPⅠbα的水解，增强血小板在体内的止血功能［22］。由此Bergmeier等推测CCCP处理的和衰老的血小板存在着另一种不同的清除机制，也就是血小板表面GPⅠbα的切除可能在损伤血小板清除过程中起作用，因为这些血小板同样在Mac-1缺陷小鼠体内被清除，而且CCCP处理和损伤的血小板GPⅠbα几乎都被水解切除掉，由此证明这些血小板的清除与GPⅠbα亚单位的N末端结构域无关。但是，从动物实验得出的结论不能直接推广到人类。因为考虑到人血小板保存条件的不同，CCCP孵育等实验条件的不同，以及人与鼠的血小板对温度的反应性不同等等，因此该结论还需要进一步的实验论证［12］。
展望
虽然近期的实验研究发现P-选择蛋白、GPⅠbα以及内源性金属蛋白酶可能在回输血小板体内清除过程中起作用，但仍有一些重要问题有待于进一步的研究，如P-选择蛋白体内水解机制，表面GPⅠbα与其受体识别相关的信号转导机制，以及血小板调亡是否与血小板体内清除有关等。对于上述问题的进一步深入研究将有助于延长血小板保存后体内存活期，更好的发挥血小板的功能，解决血小板临床供应不足的问题。
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