浙江汉族DEL表型基因分型方法的建立

            作者：吴俊杰，洪小珍，马开荣，许先国，傅启华，严力行

【摘要】  为了快速鉴定DEL表型，建立浙江汉族DEL表型的基因分型方法，根据RHD 1227A等位基因序列设计等位基因特异性-聚合酶链反应(allele specific - polymerase chain reaction, AS-PCR)，用于DEL表型的基因分型。用已知RHD 1227A多态性的样本和已知DEL表型的样本评价基因分型方法的灵敏度和特异性。结果表明：在50例RHD 1227A阳性和50例RHD 1227A阴性的Rh阴性样本中基因分型方法的灵敏度和特异性都是100％；在33例DEL阳性样本和89例DEL阴性的样本中，基因分型方法的灵敏度为100％，有2例样本血清学结果为阴性而基因分型结果为阳性，重新用血清学方法和序列分析方法复核这2例样本，发现2例都是血清学漏检，因而基因分型方法的特异性是100％。 结论： 设计的基因分型方法可以有效地鉴定浙江汉族Rh阴性人群中的DEL表型。

【关键词】  DEL表型； RHD 1227A等位基因； 基因分型

　　Establishment of Genotyping Method for DEL Phenotype in Zhejiang Han Population

　　Abstract In order to establish a genotyping method for DEL phenotype in Zhejiang Han population, an AS-PCR method was developed according to the RHD 1227A allele sequence. Its specificity and sensitivity were assessed in two Rh negative populations whose RHD 1227A or DEL phenotype status was known.   The results showed that in evaluation of  the method by detecting 50 RHD 1227A positive and 50 RHD 1227A negative individuals, the genotyping method displayed  a sensitivity of 100% and a specificity of 100%;  in evaluation of the method by  detecting 33 DEL positive and 89 DEL negative individuals,   the sensitivity was 100%, however, there were two serologically negative samples which were confirmed as  positive using genotyping method. After re-testing these two samples with serological method and sequence analysis, it was found that original serological method gave  false negative results and genotyping method still showed  100% specificity. The minimal target DNA concentration of this  genotyping method is 8.13 ng/μl. In conclusion,  designed  genotyping method can be used to identify DEL phenotype efficiently in Zhejiang Han Rh negative population.

　　Key wordsDEL phenotype;  RHD 1227A allele; Genotyping

　　Rh血型中D抗原在输血医学和产中意义最为显著。最近的研究发现，DEL表型（一种极弱表达的D抗原，只有通过吸收释放的方法才能检测到，称为DEL抗原）的血液输注给Rh阴性患者仍会产生抗D免疫反应［1］，因此，对DEL抗原的免疫原性应予以重视［2-4］。目前常用的血清学DEL表型鉴定方法由于步骤繁琐而不适合临床大规模应用，如何快速有效的鉴定DEL表型已成为一个具有重要临床意义的课题。我们的研究发现，浙江汉族DEL表型和RHD 1227A相关（未发表研究结果）。根据RHD 1227A等位基因序列，我们设计了1种AS-PCR方法，通过检测100例RHD 1227A多态性已知的Rh阴性样本和122例DEL表型已知的样本，对该方法用于浙江汉族Rh阴性人群中DEL表型基因分型的适用性进行评价。

　　材料和方法

　　对象

　　在浙江省居住或者工作的无亲缘关系Rh阴性汉族献血员222例，包括50例RHD 1227A阳性和50例RHD 1227A阴性（参照［5］，序列分析确定RHD 1227A位点的多态性）、33例DEL阳性和89例DEL阴性(DEL表型采用氯仿释放的方法鉴定，见参考文献［6］)。

　　Rh表型血清学鉴定

　　RhD表型鉴定采用常规盐水平板法，使用加拿大Dominion公司的IgM和IgG混合的抗D试剂。RhC、Rhc、RhE和Rhe鉴定采用盐水试管法，试剂为Dominion公司的相应单克隆抗体。

　　基因分型

　　根据RHD基因和RHD 1227A等位基因相关序列设计一组特异扩增RHD 1227A等位基因的引物：RHDEL-s:   5'-GACCAAGTTTTCTGGAAA-3' （位置对应于AJ299028的68-85）、RHDEL-a:   5'-CGAGAG-AATTTTGAGCAC-3'  （位置对应于AB035185的849-832）。1对特异扩增人生长激素基因429  bp的引物作为内对照，HGH-s：  5'-GCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3';  HGH-a：  5'-TCACGGATTTCTGTTGTGTTT-3'。反应总体积10 μl，含模板DNA  0.2  μl（约含DNA 50-60  ng），特异性引物终浓度250  nmol/L，内对照引物终浓度50 nmol/L，MgCl2 终浓度1.5 mmol/L，dNTP终浓度 200  μmol/L，Taq酶0.2 U（TaKaRa公司产品）。PCR扩增条件： 95℃预变性5分钟，然后94℃ 变性30秒、58℃ 退火30秒和72℃ 延伸50秒，循环30次，最后72℃延伸5分钟。产物通过2％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪（Syngene公司产品，英国）观察结果。

　　基因分型方法DNA浓度检测下限评估

　　将RHD 1227A阳性的DNA用BioPhotometer（Eppendorf公司产品，德国）测得浓度，用RHD 1227A阴性的DNA作为稀释液，倍比稀释RHD 1227A阳性样本。稀释后DNA的PCR产物通过2％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪（Syngene公司产品，英国）观察结果。

　　结果

　　RHD 1227A多态性已知的Rh阴性人群

　　在100例Rh阴性人群中，用基因分型方法扩增50例RHD 1227A阳性样本，都可扩增得到867 bp的特异条带和429 bp的内对照条带，即结果都为阳性；扩增50例RHD 1227A阴性样本，都只能扩增出429  bp的内对照条带，即结果都为阴性。这表明基因分型方法在该群体中检测RHD 1227A的灵敏度和特异性都为100％。电泳图见图1。

　　DEL表型已知人群的Rh阴性人群

　　在122例DEL表型已知的人群中，用基因分型方法扩增33例DEL表型阳性样本，结果都为阳性，扩增89例DEL表型阴性样本，结果有2例（RhCedee）为阳性，87例为阴性。用原始的DEL表型鉴定结果做参照，基因分型方法在该群体中检测DEL表型的灵敏度为100％，特异性为97.75％。

　　血清学方法和基因分型方法结果不一致样本

　　对DEL表型血清学方法检测结果为阴性、基因分型检测结果为阳性的2例样本重新取样分析。血清学吸收释放结果为DEL阳性，外显子9序列分析结果为RHD 1227A为阳性。即2例样本的基因分型结果和血清学结果不符是由于原始血清学方法的漏检DEL表型造成。因此，基因分型方法的特异性仍然为100％。

　　基因分型方法的DNA浓度检测下限

　　将RHD 1227A阳性的DNA用RHD 1227A阴性的DNA倍比稀释后，3份样本都可以在稀释32倍后，仍然可以扩增到比较清楚的阳性条带（图2）。稀释64倍的样本扩增结果不可见。3份样本原始DNA浓度分别为290 ng/μl、250 ng/μl和240 ng/μl，取算术平均值260 ng/μl。基因分型方法的DNA浓度检测下限以稀释32倍，约为8.13 ng/μl。

　　讨论

　　亚洲Rh阴性人群有很高比例的DEL表型，并且各地DEL表型的分子机理不尽一致［7-12］。人群DEL分子机制主要有外显子9缺失和RHD 1227A等位基因2种［7-10］。中国深圳人群DEL的分子机制主要由RHD 1227A等位基因引起，和3' 非翻译序列无关［11-12］。我们未发表的研究结果表明,浙江汉族人群DEL分子机制也是由RHD 1227A等位基因引起。因此，我们根据RHD 1227A等位基因序列设计了AS-PCR方法用于DEL表型的基因分型检测。通过检测100例RHD 1227A多态性已知的Rh阴性样本，我们证明该基因分型方法可以有效的检测RHD 1227A等位基因，并且该方法的DNA浓度检测下限约为8.13 ng/μl，对Rhccdee等DEL表型阳性概率比较低的样本可以通过检测5-10份样品的混合样来提高工作效率。检测122例DEL表型已知的样本发现，基因分型结果和原来的血清学DEL表型结果有2例不一致。重新取样做血清学鉴定和序列分析发现，这2例基因分型结果阳性、血清学结果阴性样本是由于血清学方法的漏检造成。血清学漏检DEL表型可能与不同批号抗D试剂的效价、血样的新鲜程度、抗人球蛋白试剂的效价和灵敏度以及吸收释放操作步骤标准化程度等众多因素有关，这也提示基因分型方法比血清学DEL鉴定方法灵敏度更高，重复性更好。另外，基因分型方法还可以利用血站的核酸检测系统实现自动化检测。基因分型的灵敏度和特异性在我们的研究样本中都为100％，表明该法可以用于检测浙江汉族Rh阴性人群中的DEL表型。据我们所知， 国内尚未有DEL表型基因分型方法的报道。用我们的基因分型方法可以简便地在Rh阴性人群中鉴定DEL表型，便于将来系统研究DEL抗原的免疫原性，从而更安全的使用DEL血液。

【】
  　　1 Wagner T, Kormoczi GF, Buchta C, et al. Anti-D immunization by DEL red blood cells. Transfusion, 2005; 45: 520-526

　　2 Flegel WA. Homing in on D antigen immunogenicity. Transfusion, 2005; 45: 466-468

　　3 Avent ND. High variability of the RH locus in different ethnic backgrounds. Transfusion, 2005; 45: 293-294

　　4 王晓珠，兰炯采，吴绪华等. Rh弱D及Del样本的检测研究. 中国实验血液学杂志，2005； 13: 509-511

　　5 吴俊杰，洪小珍，许先国等. 中国人Rh部分D表型的分子机理研究. 中国实验血液学杂志，2006； 14：587-591

　　6 Vengelen-Tyler V. Technical Manual. 12 ed. Bethesda: American Association of Blood Banks. 1996：578-579

　　7 Sun CF, Chou CS, Lai NC, et al. RHD gene polymorphisms among RHD-negative Chinese in Taiwan. Vox Sang, 1998，75:52-57

　　8 Chen JC, Lin TM, Chen YL, et al. RHD 1227A is an important genetic marker fro RHD(el) individuals. Am J Clin Pathol, 2004; 122: 193-198

　　9 Lee YL, Chiou HL, Hu SN, et al. Analysis of RHD genes in Taiwanese RHD-negative donors by the multiplex PCR method. J Clin Lab Anal, 2003; 17:80-84

　　10 Chang JG, Wang JC, Yang TY, et al. Human RHDel is caused by a deletion of 1,013 bp between introns 8 and 9 including exon 9 of RHD gene. Blood, 1998; 92: 2602-2604

　　11 Shao CP, Maas JH, Su YQ, et al. Molecular background of RHD-positive, D-negative, D(el) and weak D phenotypes in Chinese. Vox Sang, 2002; 83:156-161

　　12 邵超鹏，何春辉. RhD基因3'-非编码区序列分析. 中国实验血液学杂志，2005； 13：219-221.