痔疮组织中血管内皮生长因子的表达及意义
作者：徐跃军 张端莲 吴惠芬 蔡丽华
【摘要】 目的:观察血管内皮生长因子在痔疮组织中的表达及临床意义。方法:收集武汉市第八肛肠科手术切取的痔疮组织40例，另取痔疮组织周围正常组织5例作对照。应用免疫组织化学方法检测痔疮组织及周围正常组织中血管内皮生长因子的表达，利用HPIAS-2000图像分析系统测定血管内皮生长因子在以上两组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果:痔疮组血管内皮细胞内血管内皮生长因子呈阳性表达，正常对照组血管内皮细胞内血管内皮生长因子呈阴性表达。 免疫组织化学结果表明痔疮组血管内皮细胞内血管内皮生长因子表达明显高于正常组织血管内皮细胞，有显著性差异（ P <0.01 ）。图像分析结果显示，痔疮组与正常对照组之间血管内皮生长因子平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义（ P<0.01）。结论:血管内皮生长因子在痔疮的形成过程中起了重要的作用。
【关键词】 痔疮; 血管内皮生长因子; 免疫组化
痔是人类常见的一种疾病。痔被认为是直肠下端或肛管存在丰富的静脉丛，如果在一处或数处发生扩张或曲张，即成为痔，亦即痔是突出的静脉团，是各种原因造成的血管病变，但确切机制还不清楚。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）又称血管通透性因子，是目前所知作用最强的一种促血管生长因子，是新生血管形成的中心调控因子和血管内皮细胞特异的有丝分裂原。血管内皮生长因子的过量表达对血管内皮细胞的异常增殖及小血管的过度形成起重要作用。本课题应用免疫组织化学的方法研究了VEGF与痔形成的关系，旨在进一步探讨痔疮形成的确切机制。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1材料来源 收集武汉市第八医院肛肠科手术切取的痔疮组织40例，另取痔疮组织周围正常组织5例作对照。其中男性25例，女性15例。患者术前均未做任何辅助性。
1.1.2材料分组 蜡块切片厚5μm，贴片于涂有多聚赖氨酸的洁净载玻片上，置于烤箱烤干待用。常规HE染色和免疫组织化学S-P法检测血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）。
2材料和方法
2.1主要试剂和仪器
2.1.1主要试剂 即用型鼠抗人VEGF单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）;超敏即用型S-P通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新生物有限公司）;DAB显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。
2.2主要仪器YWY781型医用微波仪（250W，50Hz），浙江临安器材厂生产;家用高压锅。
2.3方法
2.3.1常规HE染色 取材、固定、脱水、透明、切片和HE染色。
2.3.2免疫组织化学S-P法检测VEGF相关抗原主要步骤:①组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗;② 3%过氧化氢，37℃孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min;③ VEGF采用微波抗原修复（3档，10min），PBS洗4×5min;④ 正常羊血清37℃孵育10min以减少非特异性反应;⑤ 一抗VEGF37℃孵育1 h，PBS洗4×5min;⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min;⑦ 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min;⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应;⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。
2.4免疫组织化学结果判断 VEGF相关抗原以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反应物。 采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对VEGF表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下VEGF阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%
2.5统计学处理对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK- q检验，检验水准α 为 0.05。
3结果
3.1HE染色正常对照组可见肛管黏膜下为海绵状的血管组织，并有丰富的动、静脉吻合管，又称为直肠海绵体，是由血管、平滑肌、弹力纤维和结缔组织所构成的，其血管和结缔组织结构正常。痔疮组可见病变区血管扩张，血液淤滞，组织水肿，血凝块形成，以及纤维断裂。有部分严重病例可见局部组织坏死、糜烂出血。
3.2VEGF的表达痔疮组血管内皮细胞胞浆内可见较多棕黄色颗粒沉积，VEGF表达呈阳性;正常对照组血管内皮细胞胞浆内无棕黄色颗粒沉积，VEGF表达呈阴性。图像分析结果显示:痔疮组中VEGF的平均光密度为0.1853±0.0211，正常对照组中VEGF的平均光密度为0.1043±0.0117;痔疮组中VEGF的阳性面积率为0.3761±0.0527，正常对照组中VEGF的阳性面积率为0.0869±0.0183。见表1。
表1 VEGF在痔疮组和正常对照组中表达的平均光密度和阳性面积率（略）
注:* 痔疮组与正常对照组比较， P <0.01。
4讨论
痔是肛垫病理性肥大、移位及肛周皮下血管丛血流淤滞形成的局部肿块。目前认为成痔的原因与解剖、感染、便秘、不良的排便习惯、饮食习惯、遗传、职业、疾病、妊娠和分娩等各种因素有关［1］。常见有以下几种原因: ①习惯性便秘，腹压增加; ②经常吃刺激性食物及饮酒;③慢性腹泻; ④门静脉压力增高; ⑤妊娠、盆腔肿瘤、排尿困难等; ⑥年老体弱、肌肉无力、组织松弛。“肛垫”又称痔的原发区，是痔概念的解剖生基础［2］，是肛管黏膜下为海绵状的血管组织，并有丰富的动、静脉吻合管，又称为直肠海绵体，是由血管、平滑肌、弹力纤维和结缔组织所构成的。肛垫上皮有精细的辨别觉，有多种化学性和机械性受体，可引发保护性肛门反射，对维持正常排便活动有着极其重要的意义。肛垫黏膜下层有丰富的动静脉吻合管，使肛垫静脉丛的功能接近动脉血管。从18世纪开始，痔被认为是直肠下端或肛管存在丰富的静脉丛［3］，如果在一处或数处发生扩张或曲张，即成为痔，亦即痔是突出的静脉团，是各种原因造成的血管病变。血管内皮生长因子又称血管通透因子（Vascular permea-bility factor，VPF）或血管调理素（Vasculotropin），是1989年 Ferrara［4］等在牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中首先纯化出来的糖蛋白。随后在鼠垂体前叶肿瘤细胞系AtT20、人单核细胞、鼠神经胶质瘤细胞系等细胞培养液中也纯化出了VEGF蛋白。VEGF是已知最强的血管通透剂，可达组胺的50000倍，且不能被组胺抑制剂所阻断［5］。VEGF可以增加毛细血管后静脉和小静脉的通透性，其作用机制是:VEGF结合血管内皮细胞在管腔外侧VVO（vesiculo-vacuolar organelle）的细胞器上［6，7］，VEGF 作用后，引起 VVO囊液泡间膜的开启，促进大分子物质跨内膜转运;血管通透性的增加导致间质水肿，血液中的血浆蛋白、纤维蛋白质、液体等外渗，引起细胞外基质改变，为血管内皮迁移提供支架，在多种细胞因子和蛋白溶酶的协同作用下，迁移的细胞分裂增殖形成新生血管芽［8］。VEGF能特异性地促血管内皮细胞分裂增殖，促血管生成，同时增加血管通透性，使血管内成份渗漏，为血管内皮的迁移及血管形成提供基质。从我们的实验结果显示:痔疮组血管内皮细胞胞浆内可见较多棕黄色颗粒沉积，VEGF表达呈阳性;正常对照组血管内皮细胞胞浆内无棕黄色颗粒沉积，VEGF表达呈阴性。痔疮组血管内皮细胞内血管内皮生长因子表达明显高于正常组织血管内皮细胞，有显著性差异（ P <0.01 ）。在痔疮组血管内皮生长因子的过量表达对血管内皮细胞的异常增殖及小血管的过度形成起重要作用，表明痔疮的病理过程伴有组织中血管内皮细胞中VEGF的高表达，意味着痔疮的形成过程中VEGF能特异性地促血管内皮细胞分裂增殖，促血管生成， 并促使肛管黏膜下的血管发生扩张或曲张，其确切机制有待进一步探讨。
【】
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