威麦宁抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤的生长及其血管生成的实验研究
作者：吴学敏 金艳书 娄金丽 刘运芝
【摘要】 目的：探讨威麦宁对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长及其血管生成作用的影响。方法：建立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型，用药后取瘤组织称重并抑瘤率；瘤组织切片HE染色，光镜下进行形态学观察；免疫组化法检测瘤组织血管内皮细胞CD34的表达情况并计数微血管密度(MVD)。结果：威麦宁浓度在100mg/kg.d、250mg/kg.d时，对小鼠Lewis肺癌的抑制率分别为19.14%和51.56%；对照组癌巢间微血管丰富，用药组瘤组织及其周围微血管均减少；用药组瘤组织内MVD明显低于NS组(P<0.01)。结论：威麦宁能减少肿瘤组织血管生成，从而抑制小鼠移植瘤的体内生长。
【关键词】 威麦宁 Lewis肺癌 血管生成
肿瘤新生血管的形成不仅是肿瘤可持续生长的基础，也为其侵袭和转移创造了十分有利的条件。因此，抑制肿瘤微小克隆对周围血管组织的诱导，防止其最初的血管形成，对原发肿瘤的以及转移灶的控制具有重要意义。
金荞麦为蓼科植物天荞麦的根状茎，具有清热解毒、祛风利湿作用，是民间常用的中草药。威麦宁为金荞麦干燥根茎提取的单宁类化合物。研究发现，威麦宁具有抗肿瘤［1］及抗肿瘤转移作用［2］。本研究以Lewis肺癌的荷瘤小鼠为对象，研究威麦宁抑制肿瘤生长的作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物与瘤株
C57 BL/6 雌性小鼠，体重(18±1)g，由医学院实验动物研究所提供，许可证号：SCXK?11?00?0006。瘤株：小鼠Lewis肺癌细胞株(Lewis Lung Carcinoma, 3LL)，中国医学科学院药物研究所提供。
1.2 药品与试剂
威麦宁(北京华颐中药制药厂)，环磷酰胺(CTX，中美合资山西泰盛制药有限公司)，CD34免疫组化试剂盒(福州迈新生物技术开发公司)。
1.3 威麦宁对荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影响
将Lewis肺癌C57 BL/6荷瘤小鼠处死，取肿瘤组织并制成小鼠Lewis肺癌单细胞悬液，调整细胞浓度为1×107/mL,活细胞数大于95%。取40只C57 BL/6小鼠，每只小鼠右侧腋部皮下接种0.2mL。接种后按体重随机分组，每组10只。生理盐水(NS)组：每只灌胃0.3mL生理盐水；威麦宁低(WML)、高(WMH)剂量组：分别按100mg/kg.d、250mg/kg.d摄入量灌胃给药，每只0.3mL；环磷酰胺(CTX)组：按60mg/kg腹腔注射给药1次。给药开始于接种后第2d，给药10d后停药，次日处死小鼠，剥离肿瘤组织称重，计算抑瘤率。
抑瘤率=(实验组的平均瘤重/对照组的平均瘤重)×100%
1.4 瘤组织HE染色
瘤组织用10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋、切片(厚度为4μm)、HE染色，光镜下观察。
1.5 瘤组织内微血管密度(MVD)的检测
各组肿瘤组织切片常规脱蜡、水化，EDTA液抗原修复后，加抗鼠CD34单克隆抗体，然后按福州迈新两步法试剂盒操作步骤进行：加试剂A和B，加新配制的底物DAB溶液。苏木素复染，盐酸酒精分化，梯度酒精脱水干燥，中性树胶封片。实验设阳性与阴性对照。
结果判定标准：CD34阳性内皮细胞被染成棕黄色。由内皮细胞形成的条状、隙状等孤立或簇状结构并有管腔，且管腔小于8个红细胞大小者为一条血管；相互分离的内皮细胞但无明显管腔亦按1条血管计数。血管腔大于8个红细胞或管壁可见平滑肌者不计入内［3］。
微血管密度计数方法：先在低倍镜下(100倍)确定3个CD34阳性着色最密集的区域，然后在高倍视野(400倍)下计数微血管，取3个视野的均值作为微血管密度(MVD)。肿瘤内硬化区域和肿瘤细胞稀少区域内的微血管不进行计数。
1.6 统计分析
采用SPSS 10.0软件进行方差分析。
2 结果
2.1 威麦宁对Lewis肺癌小鼠瘤重及抑瘤率的影响
WMH、CHX两组小鼠瘤重减轻，与对照组相比显著差异(P<0.01或P<0.001)。见表1。表1 威麦宁对小鼠瘤重及抑瘤率的影响(略)注：* P<0.01，** P<0.001。
2.2 威麦宁对小鼠Lewis肺癌瘤组织形态学变化的影响
经HE染色后镜下观察，可见瘤组织内肿瘤细胞密集排列，瘤细胞大小不同，形态各异，呈明显的异质性。NS组肿瘤细胞呈片状或巢状分布且生长旺盛，癌巢间微血管丰富。WMH组可见不同程度的片状坏死区，瘤组织及其周围微血管均减少，但CTX组减少不明显。
2.3 威麦宁对小鼠Lewis肺癌瘤组织微血管密度(MVD)的影响
肿瘤组织内可见形态不规则，有或无明显管腔的新生血管，血管分布以癌巢组织的边缘处为多见。各组瘤组织微血管密度见表2，可见WMH能明显降低瘤组织微血管密度(P<0.01)。表2 威麦宁对Lewis肺癌瘤组织微血管密度的影响(略)注：* P<0.01。
3 讨论
威麦宁是金荞麦概茎乙醇提取物，本实验采用威麦宁给Lewis肺癌荷瘤小鼠以100、250mg/kg.d灌胃10d，抑瘤率分别为19.14%和51.56%。据报道，威麦宁口服剂量250～270mg/kg.d，对胰腺癌抑制率为39.2%～62.5%，肺癌为37.2%～69.8%。本结果与此相似［4］，表明威麦宁有一定抗癌作用。
肿瘤血管生成与生理条件下的血管生成有很多相似之处，但也有很大的差异，主要表现为无控制和未成熟性。肿瘤血管新生的过程在很大程度上受血管生成因子和血管生成抑制因子的调节。肿瘤细胞、内皮细胞和巨噬细胞受缺氧等使局部微环境发生变化的因素作用而合成和释放上述因子，当两者之间的平衡被打破，即发生血管生成过程。新生血管形成既是肿瘤生长所必需，也是肿瘤转移的基础之一，而且微血管密度与肿瘤的生长与转移呈正相关［5］。
通常运用一些特异性抗体如抗Ⅷ因子抗体、抗CD34抗体、抗CD31抗体等标记肿瘤血管内皮细胞，计数单位面积中的微血管数目，即为微血管密度(MVD)，来衡量肿瘤血管生成的活跃程度。我们应用抗CD34抗体进行免疫组化检测，结果表明威麦宁能抑制瘤组织中微血管的形成，与对照组相比差异显著(P<0.01)，而CTX抑制瘤组织微血管生成作用不明显(P>0.05)。这一结果与瘤组织HE染色形态学观察结果相符合(即WMH组瘤组织及周围微血管明显减少)。由此我们认为威麦宁可能是通过抑制肿瘤微血管生成达到抑制肿瘤生长作用的。据此我们还可以推断威麦宁可能具有抗肿瘤转移作用，同时也证实了CTX主要是通过细胞毒作用发挥抗肿瘤作用的。
【文献】
1 陈晓锋，顾振纶.金荞麦抗肿瘤作用研究进展.中草药，2000，31(9)：715～718.
2 娄金丽，林洪生，邱金瑛，等.威麦宁抗小鼠移植型肺癌转移作用机制的研究.病理生杂志，2004，4：627～631.
3 Weidner N. Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumor. Breast Cancer Res Trent, 1995,36(1):169～173.
4 吴友仁.金荞麦抗癌研究.肿瘤防治.北京：中国技术出版社，1989，987～989.
5 Zetter BR. Angiogenesis and tumor metastasis. Annu Rev Med， 1998,49:407～424.
