流式细胞术检测巨噬细胞吞噬功能的方法建立
【摘要】 目的：建立用流式细胞术检测小鼠腹腔诱导的巨噬细胞吞噬功能的方法。方法：用贴壁法筛选有活性的巨噬细胞，再与用碳酸盐缓冲液制备的荧光素(FITC)标记的大肠埃希菌混合，37℃孵育，每10min取少量固定后加EB染巨噬细胞核，用流式细胞仪检测，巨噬细胞对大肠埃希菌的吞噬率。结果：FITC能够有效标记大肠埃希菌；小鼠腹腔诱导的巨噬细胞能够吞噬大肠埃希菌，并且在30min时达到最大峰值。结论：用流式细胞术检测小鼠巨噬细胞吞噬FITC标记大肠埃希菌是测定巨噬细胞吞噬功能简便、快速和重复性好的定量方法。
【关键词】 巨噬细胞 吞噬作用 大肠埃希菌 流式细胞仪
Establish a New Method of Detecting Phagocytosis of Macrophage by Flow Cytometry
Abstract Objective: To use a new method of detecting phagocytosis of macrophage induced from the Belly of mouse by flow cytometry. Methods: Firstly, the living macrophages were collect by cultivating and adherencing, and bacterium coli(E. coli) was labeled FITC. Secondly, E. coli was mixed with macrophages, every 10 minute to take out of small amounts of mixed liquor,and add a little of EB dye. Finally, the fluorescent intensity was measured by flow cytometry. Results: The E. coli was labeled well by FITC in carbonate buffer. Macrophage can phagocytize E. coli and the efficient rat of phagocytosis was highest about at 30 minute. Conclusion: The method that detecting phagocytosis of macrophage phagocytizs E. coli is convenient、fast、good repeatability.
Key words macrophage; phagocytosis; bacterium coli; flow cytometry
巨噬细胞(macrophage，MP)是机体天然免疫的主要免疫细胞，吞噬率则直接反映巨噬细胞的吞噬功能。通常测定吞噬率的方法是对吞噬细菌的MP染色后在显微镜下观察、计数的方法，也有研究者用流式细胞仪(Flow Cytometry，FCM)检测MP的吞噬功能［1,2］。我们在检测小鼠MP吞噬细菌的实验中发现，小鼠MP的形态较小，染色后在显微镜下观察计算吞噬率较为困难。本研究试建立用流式细胞术FITC?EB法检测MP的吞噬功能，以求找到一种简便、客观和重复性好的方法。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 主要试剂
FITC；EB；2%淀粉肉汤；大肠埃希菌DH5A；2%琼脂LB固体培养基；含血清培养基；流式细胞仪四色校准微球(CaliBRITEBeads，美国BD公司)。
1.1.2 实验动物
BALB/C小鼠，25只，体重(19±2)g,由本院免疫学教研室保存提供。
1.1.3 主要仪器和软件
隔水恒温培养箱，型号：GNP?9270 (上海精宏实验设备有限公司)；自控式CO2细胞孵育箱,型号：2300（美国Shellab公司）；分光光度计，型号：Jenway 6305 (Barloworld公司)；蔡司荧光显微镜，型号：ZEISS AXIO Imager.A1 (蔡司光学仪器（上海）国际贸易有限公司)；流式细胞仪，型号：FACSCalibur (美国BD公司)；CellQuest软件。
1.2 实验方法
1.2.1 大肠杆菌培养及标记荧光素(FITC)
接种大肠杆菌于2%琼脂LB固体培养基表面皿上，在37℃隔水恒温培养箱中孵育48h，取少量菌落用PBS洗，革兰氏（图1）和G?W染色观察（图3），并调节浓度(OD≈0.40在620nm处）。荧光素标记大肠杆菌［3］：离心去上清，加入250ul 1%Triton X?100 和1ml FITC（0.01mg FITC/500ul 碳酸盐缓冲液）37℃避光孵育15min，离心去上清，少量PBS重悬细菌待用，并用荧光显微镜观察（图2）。
1.2.2 巨噬细胞吞噬大肠杆菌
诱导、筛选腹腔巨噬细胞：腹股沟注入1ml2%淀粉肉汤液，48h后开腹腔收集渗出液，培养基洗一次，转入培养瓶中37℃ CO2孵育箱孵育2h，收集贴壁细胞（1×107event）于离心管中4ml培养基重悬待用，并G?W染色观察（图3）。检测巨噬细胞吞噬大肠杆菌：加FITC标记大肠杆菌于巨噬细胞培养液中，置于37℃水平摇床上（慢速摇动），每10min取摇匀液0.5ml，PBS洗一次，70%乙醇固定10min，离心后加入1ml EB(0.5μg/ml)，37℃避光孵育15min待测。首先使用BD CaliBRITE Beads试剂调整仪器，设定仪器基本参数，上样后先用FSC?H/SSC?H圈定MP，再采集红色荧光强度，并计算实际吞噬率（某时刻实际吞噬率=某时刻吞噬率-0min时的吞噬率），同时取少量G?W染色观察（图3）。
1.3 统计分析
采用SPSS11.0软件进行统计分析，数据以±s表示，P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 小鼠巨噬细胞吞噬FITC标记大肠埃希菌的定量观察
由大肠埃希菌的革兰氏染色图像（图1）可以看出：大肠埃希菌为革兰氏阴性菌，并没有其他细菌污染，可以应用于吞噬实验；由大肠埃希菌的荧光显微镜观察（图2）可以看出：用碳酸盐缓冲液(pH=9) 制备的荧光素(FITC)能够有效标记大肠埃希菌；在不同时间段G?W染色观察巨噬细胞吞噬大肠埃希菌过程的图像（图3）中可以看出：在0～20min内巨噬细胞吞噬大肠埃希菌的量逐渐增加（巨噬细胞吞噬泡中大肠埃希菌的量增加），30min左右时巨噬细胞吞噬量最高，40min后巨噬细胞吞噬量有减少趋势（吞噬泡中有明显的溶菌现象，泡内大肠杆菌形态逐渐模糊）。
2.2 小鼠巨噬细胞吞噬FITC标记大肠埃希菌的动力学特点
小鼠巨噬细胞与FITC标记大肠埃希菌在37℃作用不同时间后, 巨噬细胞的实际吞噬率在0、10、20、30、40、50min时分别为0%、11.20±2.0%、21.57±2.1%、62.22±5.0%、54.58±3.5%、37.22±4.1%，在30min左右即达到峰值（表1，图4）。表1 巨噬细胞吞噬大肠埃希菌的动力学数据(略)
3 讨论
人类细胞免疫功能一般认为应包括白细胞、红细胞及巨噬细胞等三大系统，其相应的检测指标分别为：以CD4和CD8为主的T细胞亚群检测，以RBC?C3bRR和RBC?ICR为主的红细胞免疫功能检测和以巨噬细胞吞噬率为主的巨噬细胞吞噬功能检测。但是，在临床上由于细胞免疫功能检测方法较繁琐，往往作前两项检测，对于某些免疫性疾病以及与免疫功能损伤有关疾病的诊断与中，全面地评估机体的免疫状态极为重要。
检测MP功能最常用的方法之一就是检测其对细菌的吞噬率，传统方法是取外周血与细菌混合作用后涂片染色，在显微镜下观察MP对细菌的吞噬率。该方法一般要寻找200个以上MP中吞噬细菌MP数量，操作较烦琐，且形态较小，显微镜下观察其对细菌的吞噬率更为困难。因此，已有研究者报道用流式细胞术测定中性粒细胞对荧光素标记细菌的吞噬功能［4,5］，但目前有关巨噬细胞吞噬功能的检测报道不多。
本研究在前人研究基础上［6］，选择FITC和EB双荧光性物质标记法检测MP对大肠埃希菌的吞噬功能。其检测原理是：首先利用FITC在碳酸盐缓冲液中标记大肠埃希菌，再用MP吞噬标记后的大肠埃希菌，吞噬完成后，加入EB染料标记MP，在488nm的激光下MP内大肠埃希菌上的FITC首先发出绿色荧光，其荧光又可以激发MP上的EB染料，使其产生红色荧光，通过红色荧光的表达率反映MP对大肠埃希菌的吞噬功能。实验结果显示：0～20min内吞噬率逐渐增加；30min左右吞噬率达到平台，与有关资料一致；40min以后吞噬率反而减少，有可能通过MP内溶菌酶作用把MP内细菌消化、分解，释放到细胞外，导致MP内细菌减少,荧光能力减弱。其中，在流式细胞仪荧光强度直方图中CV平均值为3.9%，由此可见，自动流式细胞仪用于检测巨噬细胞吞噬功能，不但测量数据准确性高、重复性好、操作简便、快速，而且保持MP细胞膜的完整性，能够直接体现MP对细菌的吞噬能力，同时弥补了FITC荧光性弱难以区分、检测的弱点。
本实验结果充分证明通过流式细胞术的FITC?EB法能够简便、快速和重复性好地定量检测巨噬细胞对大肠埃希菌的吞噬功能。
【】
1 张盈华,殷缨,张莉,等.流式细胞仪测定巨噬细胞吞噬率方法的建立及其应用.第四军医大学学报.2002,23(17):1559～1561.
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