大肠癌中hsp27和p14ARF的表达及意义
作者：左国进 朱润庆 刘卫容 夏东
【摘要】 目的： 研究hsp27和p14ARF在大肠癌中的表达及其与大肠癌临床病理特征的关系。方法： 利用S?P 法检测48 例大肠癌和10例大肠腺瘤以及15正常大肠黏膜组织中hsp27和p14ARF的蛋白表达。结果：①大肠癌组织中hsp27和p14ARF表达阳性率分别为79.2%、58.4%，大肠腺瘤组织中分别为40%、70%，正常大肠粘膜组织中分别为33.3%、80%；② p14ARF在高、中分化腺癌组的表达率为64.1%，显著高于低分化组22.2%（P<0.05)；③ 两者在大肠癌组织中的表达无明显相关性。结论： hsp27和p14ARF可能与大肠癌的发生有关, 同时，p14ARF的表达与大肠癌的临床病理分级有关，其低表达可能参与了大肠癌的去分化过程。
【关键词】 大肠癌； hsp27； p14ARF； 免疫组织化学
近年来的很多研究发现，肿瘤的形成、转移和预后与多因素有关。其中肿瘤细胞增殖与凋亡的失衡是肿瘤发生和的重要环节。研究表明hsp27和p14ARF在细胞增殖、分化及凋亡中发挥重要作用。本实验应用免疫组化S?P 法对大肠癌、大肠腺瘤和正常大肠黏膜组织中hsp27和p14ARF的表达进行研究, 探讨它们在大肠癌发生发展中的意义及其与临床病理表现的关系。
1 材料与方法
1.1 标本
收集武汉大学中南2005～2006年手术切除的大肠癌患者组织标本48例、大肠腺瘤10例、正常黏膜15例取自大肠癌根治标本距肿块切缘5cm 以上粘膜。肿瘤患者中男性27例，女性21例，年龄36～94岁，平均年龄65岁。按组织学分级: 其中高分化癌10 例、中分化癌29 例、低分化癌9 例; 按Dukes 分期:A 期癌13 例、B 期癌25例、C 期癌10 例。标本均用10％中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，作厚4μm的连续切片。所有组织均经病证实。
1.2 免疫组织化学方法
采用S?P 法, 操作步骤严格按照说明书进行。鼠抗人HSP27、p14ARF 单克隆抗体及S?P 试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。DAB 显色, 苏木素复杂。用已知阳性切片作阳性对照,用磷酸缓冲盐溶液(PBS) 代替一抗作阴性对照。
1.3 免疫组化结果判断
免疫组化HSP27和p14ARF阳性染色主要定位于细胞核和（或）细胞质内，表现为在胞核和胞质内有棕黄色颗粒，参照［1］方法观察hsp27和p14ARF蛋白的分布、阳性强度和阳性率。先按染色强度打分: 0 分为无色, 1 分为浅黄色, 2 分为棕黄色, 3 分为棕褐色, 染色强度需与背景着色相对比; 再按阳性细胞所占百分比打分: 0 分为阴性, 1 分为阳性细胞≤10% , 2 分为11%～ 50% , 3 分为51%～ 75% , 4 分为>75% , 染色强度与阳性细胞百分比的乘积≥2 分为免疫反应阳性(+ )。
1.4 统计学处理
采用χ2检验和四格表的精确概率法及计数资料的相关性分析，所有数据均在SPSS11.5软件上处理。以P＜0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 HSP27和p14ARF在不同组织中的表达
在48例大肠癌组织中，HSP27和p14ARF表达阳性率分别为79.2%(38/48)、58.4%(28/48)。
在10例大肠腺瘤组织中，HSP27和p14ARF各有4、7例阳性表达，阳性率分别为40%、70%。
在15 例正常肠壁组织中，HSP27和p14ARF的阳性表达与阴性对照组比较，各有5、12例阳性表达，阳性率分别为33.3%、80%，见表1。
表1 HSP27 和p14ARF在不同组织中的表达（略）
注：* 大肠癌与腺瘤组、正常大肠组比较， P＜0.05。
大肠癌组各指标的阳性表达率与大肠腺瘤、正常大肠组比较，差异具有显著性意义( P<0.05)，腺瘤组各指标的阳性表达率与正常大肠组的阳性表达率比较差异无显著性意义(P>0.05)。HSP27在各组中均有阳性表达，但在大肠癌中最高，在正常大肠组织中最低。p14ARF在大肠癌、腺瘤及正常大肠组中的表达与HSP27相反，其阳性表达率在大肠癌组最低，在正常大肠组最高。
2.2 HSP27和p14ARF的表达与大肠癌临床病理因素的关系
HSP27蛋白在癌组织学分级中的阳性表达率为: 高、中分化癌为77.1%，低分化癌为88.8%，各级癌组间比较差异无显著性(P=0.341)；在大肠癌Dukes 分期中的阳性表达率为:A期为76.9% ,B 期为80%,C 期为80% , 各期癌组间比较差异无显著性(P=0.865)；已伴淋巴结转移组的C 期癌与无淋巴结转移组的A、B期癌比较，差异无显著性(P=0.679)。p14ARF的表达与临床分期和有无淋巴结转移无明显相关性(P1=0.992；P2=0.600)，仅和病理分级有关，高、中分化腺癌组的表达率为64.1%，显著高于低分化组22.2%，差异有统计学意义(P=0.031) ，见表2。
表2 hsp27和p14ARF的表达与大肠癌临床病理因素的关系（略）
2.3 大肠癌组织中HSP27和p14ARF表达的相关性
本实验结果显示HSP27和p14ARF在大肠癌中的表达没有明显相关性(P>0.05)，可能与本实验的例数不足有关。
3 讨论
大量研究显示,大肠癌的发生经历了多个阶段,涉及多种基因的改变，但确切机制仍不清楚。
热休克蛋白是细胞在应激原特别是环境高温诱导下所生成的一组高度保守性蛋白质,其主要作用是通过在应激状态下生成保护细胞生命活动必需的蛋白质以维持细胞的生存。其中热休克蛋白27（HSP27）是小分子热休克蛋白（sHSPs）亚家族中的重要一员,参与调节细胞的增殖、分化和细胞凋亡的信号转导等,具有重要的生物学功能。随着研究的深入,HSP27 与肿瘤的关系日益受到重视。有学者先用热休克方法诱导前列腺癌细胞产生HSPs( HSP27 和HSP72) ,再应用放线菌素等化学试剂和放射线诱导癌细胞凋亡,与对照组相比, HSPs 组显著增强了肿瘤细胞抵抗上述细胞毒因素的促凋亡作用,表明HSPs 对肿瘤细胞凋亡有抑制作用［2］ 。在乳腺癌患者体内HSP27过度表达可使发病间期缩短,是恶性乳腺癌预后不良标志［3］ 。HSP27 还可影响肿瘤细胞对激素的敏感性,用HSP27 抗体治疗,可使乳腺癌患者的生存率提高［4］ 。我们实验发现HSP27在大肠腺瘤和正常组织中的表达与其在大肠癌组织中的表达有差异，提示HSP27可能通过调控肿瘤细胞的增殖与凋亡来参与大肠癌的发生，HSP27 结构和功能的分子机制研究也发现HSP27 可形成大分子量聚合体并具有抗凋亡活性。这可能是由于在肿瘤的形成过程中，肿瘤细胞不断增殖，合成代谢增强需要大量的HSP来调节和稳定这异常增殖过程。正常细胞，HSP27的表达受细胞周期调控，而肿瘤细胞中突变或异常蛋白质的存在刺激HSP27的合成, 使其呈现持续的高诱导表达; 同时HSP27的高表达增强了肿瘤细胞抗凋亡能力，使细胞的生长抑制效应和死亡减弱。
p14ARF基因是近年来发现的一种重要的抑癌基因,与细胞周期和凋亡的调控密切相关，其编码产物P14ARF位于p14ARF?P53细胞周期调空通路上,在G1 / S 和G2 /M 限制点中起关键作用，其可直接结合MDM2 ,使MDM2 与p53 在核内分离,解除MDM2介导的p53 的抑制,使p53 水平升高,然后启动凋亡或细胞周期阻滞。目前认为,p14ARF 基因缺失及启动子甲基化与多种肿瘤的发生发展有密切关系。在脑转移瘤［5］ 、少突胶质细胞肿瘤［6］ 中常发生p14ARF甲基化现象, 同时,p14ARF启动子甲基化而失活者,在细胞质中可以发现MDM2 而且p53 表达失活,用去甲基化试剂处理后,MDM2 又回到胞核而且p53 也表达［7］。而在膀胱癌［8］ 、口腔鳞癌［9］ 中常出现p14ARF基因缺失。p14ARF也可发生突变,但主要发生在外显子E2的5′端。当p14ARF 发生缺失、甲基化及突变时,其mRNA 及蛋白水平会相应的下降。在本研究中p14ARF在大肠癌中的表达率为58.4%，显著低于正常大肠黏膜和腺瘤组织，提示p14ARF的失表达可能参与大肠癌的发生。本研究还显示大肠癌中p14ARF表达率与腺癌分化程度呈正相关,在高、中分化腺癌组织中p14ARF表达率是 64.1 % ,低分化腺癌组织中p14ARF表达率是22.2%,差异有显著性，说明p14ARF在大肠癌分化过程中同样发挥调节作用,确切作用可能是对大肠癌肿瘤细胞恶性分化转型具有保护作用。
综上所述，hsp27和p14ARF可能与大肠癌细胞的增殖和凋亡密切相关，在大肠癌的发生和演化中起着重要的作用,其具体机制及意义仍需日后深入研究。
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