苦参碱对宫颈癌Hela细胞的作用
【摘要】 目的: 观察不同浓度的苦参碱对宫颈癌Hela细胞的作用。方法: 浓度分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml的苦参碱体外培养Hela细胞24h、48h、72h后，分别用MTT法观察苦参碱对Hela细胞的生长抑制作用、AnnexinV-PI双标染色用流式细胞仪检测苦参碱对Hela细胞凋亡的影响。结果：不同浓度的苦参碱具有抑制宫颈癌Hela细胞增殖的作用，呈明显的时间、剂量依赖性。各浓度和时间之间比较具有显著差异性（P<0.01）。FCM检测结果显示苦参碱作用后，细胞的凋亡率增加，呈现随时间和剂量依赖性。各浓度和时间之间比较也具有显著差异性（P<0.01）。结论：苦参碱对人宫颈癌Hela细胞的增殖具有明显的抑制作用，能诱导肿瘤细胞的凋亡。
【关键词】 苦参碱; 凋亡
苦参是临床常用的中药之一，是豆科植物苦参Sophora Flavescens Ait的干燥根，苦参碱类生物碱是从苦参（sophora flavescens ait）提取的具有广泛药理作用的活性物质［1］。近年研究苦参碱能抑制很多肿瘤的增殖和导致其肿瘤细胞的凋亡，在胃癌细胞SGC?7901［2］、口腔上皮癌KB细胞［3］、大肠癌HT?29细胞［4］和结肠癌SW1116细胞［5］中已做了大量的实验进行凋亡机制的研究，但是对宫颈癌Hela细胞的研究还未见报道。本实验旨在研究苦参碱抑制宫颈癌Hela细胞增殖和导致其凋亡的作用，探讨其对宫颈癌可能的作用机制。
1 材料与仪器
1.1 主要试剂
苦参碱注射液（商品名：永新）0.15g/支，购自扬子江药业集团有限公司，产品批号 ：05110501；RPMI?1640 培养基和胰酶（EDTA），美国Gibco 公司产品；新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，噻唑蓝(MTT)染液为北京中山公司产品；Annexin V?FITC/PI 凋亡检测试剂盒，Bender Medsystem 公司产品，晶美生物工程有限公司代理。
1.2 仪器设备
超净工作台，细胞培养箱（HG303?3K）；倒置显微镜 OLYMPUS；流式细胞仪（Coulter Epics XL），酶联免疫监测仪（Bio?Rad 550）。
1.3 细胞株
宫颈癌Hela细胞株由武汉大学医学院病毒研究所伍星欣教授馈赠。
2 方法
2.1 体外细胞培养
Hela细胞培养于含10％新生小牛血清、100U/ml青霉素、100mg/l链霉素的RPMI?1640培养基中，置于5％CO2、37℃、 95%饱和湿度的恒温密闭孵箱中进行常规培养，每日观察细胞的生长情况。2～3天传代一次。
2.2 MTT法检测细胞生长抑制率
取对数生长期的Hela细胞，0.02％EDTA消化、计数，以1×l05个细胞/毫升悬液200ul/孔接种于96孔培养板，24h后加入质量浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml经生理盐水稀释的苦参碱（Mat）,对照组仅加生理盐水。孵育24、48、72h后换无血清的培养基加MTT20ul继续培养,4h后弃去培养基，每孔加二甲基亚砜200ul/孔，振荡10min，在全自动酶标仪上选择波长490nm测定吸光值（A值），各组细胞的生长抑制率。 细胞抑制率=（1-实验组A/对照组A）×100％，计算细胞抑制率。实验重复3次，每次、每浓度、每时段均设6个复孔。
2.3 AnnexinV FITC/PI双标染色，流式细胞仪测定Hela细胞的调亡率
收集不同浓度（0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml）、不同时间（24、48、72h）苦参碱处理后的细胞，EDTA消化，收集1×106细胞，1000r/min离心5min，弃上清，用4℃预冷的PBS洗细胞，1000r/min离心5min弃上清，共两次。用250ul结合缓冲液重新悬浮细胞。取100ul细胞悬浮于5ml流式管中，加入5ulAnnexin V/FITC和10ul20ug/ml的PI，混匀后避光孵育15min，在反应管中加400ulPBS，流式细胞仪（FCM）分析凋亡。
2.4 统计学处理
数据采用SPSS13.0统计软件分析，采用但因素方差分析进行比较，结果采用±s表示，P<0.05具有统计学意义。
3 结果
3.1 苦参碱对宫颈Hela细胞增殖抑制作用
苦参碱以时间剂量依赖方式抑制细胞的增殖。0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml的苦参碱对细胞均有明显的抑制作用，且随着培养液中苦参碱的浓度增加和培养时间的延长，抑制作用逐渐增强，呈现时间、浓度依赖性。统计学结果显示不同时间之间具有显著差异性（P<0.01），各浓度之间也存在显著差异性（P<0.01）。
表1 不同浓度苦参碱作用Hela细胞不同时间的吸光度及抑制率（略）
注：* 不同时间比较，P>0.05。
苦参碱组（0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml）浓度、不同时间（24h、48h、72h）组对宫颈癌细胞的增殖均具有明显的抑制作用(P<0.01),随着浓度的增加，时间的延长，抑制率随之加大，存在浓度、时间的依赖关系。
3.2 AnnexinV?PI双标染色流式细胞仪分析苦参碱对Hela细胞凋亡的影响
不同浓度的苦参碱作用Hela细胞24、48、72h后，细胞凋亡发生率明显增高，随苦参碱浓度加大和作用时间延长，凋亡率明显增高，与对照组相比具有显著差异性。
表2 苦参碱作用宫颈癌Hela细胞流式检测凋亡率（略）
苦参碱诱导人宫颈癌Hela细胞具有明显的药物浓度依赖性，在同一时间段，随药物浓度的增加细胞凋亡率增加，两者呈正相关（P<0.01）。同一浓度不同时间段（24h、48h、72h）细胞的调亡率逐渐增加。2mg/ml浓度苦参碱作用72h后的调亡率最高，为24.4％。
4 讨论
宫颈癌威胁全世界妇女健康的严重疾病，在我国它一直居妇科恶性肿瘤首位。宫颈癌的主要是手术治疗为主、放化疗为辅的治疗方法，治疗的费用较高，效果也不理想。同时，手术的创伤和化疗的副作用也在一定程度上影响着患者的生活质量。现在传统的中药治疗已成为治疗肿瘤的一个途径，有关苦参碱类抗肿瘤集中的研究目前已成为抗癌中药研究的一个热点。苦参碱类作为一种传统的中药成分，在抗炎、抗心律失常、抗过敏、平喘、镇痛和抗病毒方面有很大的影响，有研究苦参碱对人乳头瘤病毒有抑制作用，在最近的研究结果表明苦参碱对于肿瘤的防治也有很大的影响［6～8］。在肿瘤的分子生物学研究中，肿瘤的发生机制有很多，但细胞凋亡始终是学术界的研究热点。细胞凋亡又称程序性细胞死亡，凋亡是通过启动其自身遗传机制，内源性DNA内切酶的激活，而发生自动死亡的过程，具有特定的形态学特征和生化标记。在生理状态下，机体通过凋亡途径清除体内衰老和异常细胞，维持机体组织的动态平衡。而对于肿瘤，如凋亡过程受抑制，将促使细胞恶性增生。
我们通过体外实验证实，经苦参碱作用后的Hela细胞的形态发生了改变，细胞由原来的多边形，形态饱满变成细胞变圆，体积缩小。MTT实验证实，苦参碱能够抑制人宫颈癌Hela细胞株的生长，其抗增殖的效应存在时间?剂量的依赖性。肿瘤细胞凋亡的机制有很多，目前的研究发现导致肿瘤的发生除了经典的Bcl?2蛋白过表达直接或间接抑制了凋亡以外［9］，另外一组调节凋亡分子在1993年Crook［10］为了鉴定病毒感染的调节子过程中被从杆状病毒中发现，即凋亡蛋白抑制剂(inhibitot of apoptosis proteins， IAPs)家族。从流式细胞仪的结果我们可以发现，苦参碱能诱导Hela细胞的凋亡，随着苦参碱浓度和时间的增加，细胞的凋亡逐渐增多。但是苦参碱具体诱导人宫颈癌细胞凋亡作用的具体机制，还需要进一步进行探讨。
【】
1 梁生旺，刘伟. 中药制剂定量分析.北京：中医药出版社，1997，180～182.
2 胡梅洁，曾晖，等.苦参碱联合5?FU诱导人胃癌细胞凋亡的机制. 上海第二医科大学学报，2005，25（4）：378～381.
3 张金延，崔彗先，等.苦参碱对KB细胞及其多药耐药细胞KBv200的凋亡诱导作用.华西口腔医学杂志，2005,21(3)：254～257.
4 黄建，张鸣杰，等.苦参碱抑制大肠癌HT?29细胞环氧化酶?2表达的研究.中国中西医结合杂志，2005，25（3）：240～243.
5 邹键，冉志华，等.氧化苦参碱对人结肠癌细胞株SW1116杀伤作用的实验研究.中国消化杂志，2005，25（4）：207～211.
6 徐日强,王芳.苦参碱的近代研究进展.中华中西医杂志，2003,1(2)：112～113.
7 张鸣杰,黄建.苦参碱类抗肿瘤作用机制研究的新进展.中国中药杂志,2004，29（2）:115～118.
8 单丽华.苦参酊治疗尖锐湿疣的临床观察.中医药学报，2000，1.
9 Debatin KM．Apoptosis pathways in cancer and can cer ther?apy.Cancer Imm?unof Immunother， 2004，53：153～159.
10 Crook NE，Clem RJ，Miller LK．An apoptosis?inhibitingbaculovirus gene with a zinc fingerlike motif.Virol 1993，67：2168～2174.
