小鼠肾脏发生发育中神经型一氧化氮合酶的定量分析
作者：刘霞 包翠芬 张晓明 穆长征
【摘要】 目的： 对生后小鼠肾脏发生发育不同阶段中神经型一氧化氮合酶（nNOS)的表达进行定量分析，探讨nNOS在小鼠生后肾脏发育中的意义。方法： 分别取新生（出生小于2h）、生后3、5、7、14、40天昆明小鼠各8只，共6组,用免疫印迹技术和光密度分析方法对各组小鼠生后肾神经型一氧化氮合酶进行定量检测，以测得的一氧化氮合酶最大量为 1( 100% ) ,蛋白相对含量， SPSS10. 0统计软件包统计分析。结果： 新生组酶含量最高为100%, 随年龄增长酶含量逐渐减少，至成年达到最低水平为44.8±2.4% 。 结论： 这一趋势表明nNOS可能在小鼠生后肾脏发育的早期阶段起重要调节作用。
【关键词】 小鼠 ; 肾 ; 神经型一氧化氮合酶
一氧化氮（NO）作为体内重要的信使分子和效应分子，在调节肾脏血流动力学方面具有重要的作用。肾脏中的NO主要由一氧化氮合酶（NOS）催化产生。NOS有三个亚型，即神经型一氧化氮合酶(nNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)［1］。目前对肾发生发育过程中NO和 NOS的研究还刚刚起步 ,本实验通过定量方法检测生后小鼠的发生发育不同阶段nNOS的含量，旨在探讨nNOS在小鼠肾脏发生发育中的意义。
1 材料和方法
1.1 实验动物与分组
成年健康昆明小鼠（辽宁医学院实验动物中心提供）。根据小鼠孕程确认仔鼠出生时间 ,取新生（小于2h）、3、5、7、14、40天小鼠各8只，共6组。
1.2 主要试剂
nNOS兔抗鼠多克隆抗体（北京中杉公司）；细胞裂解液、丙稀酰胺、N，N?亚甲基双丙稀酰胺、甘氨酸、Tween20、TritonX?100、Trisbase、SDS和PVDF膜（SIGMA公司）。
1.3 Western blot步骤
各组小鼠麻醉后剖腹取右肾,PBS冲洗,迅速置于液氮冷冻,-70℃冰箱保存。取冷冻肾组织,加入3倍体积的细胞裂解液,0℃下剪碎、匀浆,将组织匀浆液静置30min,4℃,12000rpm 离心10min,留取上清液。用Bradford法测定蛋白含量,分装成每离心管中含10μg蛋白,-20℃冰箱保存。
配制10%分离胶和5%浓缩胶,取10μg(30μl)肾组织蛋白细胞裂解上清液,加入10μl SDS样品缓冲液,100℃加热3min,离心。取上述裂解液加入电泳胶样品槽,100V电压下电泳,待样品到达合适位置,停止电泳，将胶板取下,转膜液洗涤10～30min。将胶与0.45μmPVDF膜(用前置于甲醇内浸透5min左右，再放入转膜液中至少5min)置于厚滤纸(已用转膜液浸泡)之间,赶尽气泡,常温下半干转印,转印完成后将PVDF膜用TBST(TBS?1%Tueen20溶液)冲洗,5%脱脂奶粉溶液室温封闭1～2h。与一抗(兔抗小鼠nNOS抗体,稀释度为1∶400)4℃孵育过夜,TBST洗脱3次,每次至少5min； 再与二抗(碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体,稀释度为1∶200)室温孵育1h,TBST溶液洗脱3次, 每次至少5min；NBT/BCIP显色；扫描电泳条带,输入电脑,用光密度分析软件分析电泳条带光密度。
1.4 统计学分析
SPSS10.0统计软件包统计分析，组间比较采用 q检验，以 P<0.05为有统计学意义，P<0.01为有明显统计学意义。
2 结果
生后小鼠肾脏发生发育不同阶段 nNOS含量分析 Western blot电泳条带图显示新生小鼠nNOS含量最高，随着肾脏发生发育逐渐降低，到成年降低至最低水平。光密度分析显示：以测得的nNOS最大量为1,计算各组nNOS表达相对含量（百分数）。新生小鼠nNOS含量最高（100%），出生后3天降低，生后5天进一步降低，到成年降至最低水平。见表 1。
表1 小鼠生后不同阶段肾脏nNOS表达的光密度百分数（略）
注：*与成年组比较,P<0.01；#与新生组比较,P<0.05。
3 讨论
本实验表明生后小鼠发生发育不同阶段中，新生小鼠肾脏的nNOS含量最高（P<0.05）。nNOS是一种结构酶，其表达越多，则可能产生NO越多，作为新生小鼠体内唯一的血管舒张因子，通过对抗高活性血管收缩因子特别是血管紧张素Ⅱ的作用，可增加肾血流量（RBF）及肾小球滤过率（GFR），调节肾脏正常的生理活动［2］。生后小鼠早期阶段高肾血管阻力（RVR）、低RBF、低GFR的生理特点是促使nNOS表达的主要因素，可见nNOS在肾脏功能发育的早期对肾血液动力学的调节起着重要作用。此外nNOS的表达还与细胞自身的生长发育与增殖、母体较高的雌激素水平相关，另外生长因子、低氧也能上调nNOS的表达［3，4］。
在生后小鼠肾脏发生发育中，随着肾单位的形成、集合管的分化，肾功能也进一步完善，体现在RBF与GFR增加、肾小管重吸收功能完善等诸多方面。有研究表明： NOS抑制剂可以减少25%左右的肾血流量［5］。可见源于nNOS的NO对血流动力学的调节起着关键性作用，仍是维持肾血管低张力的必要物质和重要调节剂。但是随着肾脏本身结构与功能日趋完善，NO的调节作用较生后小鼠肾脏发育早期有所降低，表现为nNOS表达含量的降低。在生后小鼠肾脏发育后期，NO主要通过球旁反馈机制调节肾脏功能。生认为动物在成熟过程中许多器官和组织都能产生肾素,有局部的肾素?血管紧张素系统存在，而在成年小鼠肾脏中，血管紧张素Ⅱ可以通过肾素受体下调nNOS的含量而改变肾动脉血管张力［6］。这可以解释免疫印迹中生后小鼠肾脏中nNOS表达含量呈降低趋势的实验结果。另外，在生后肾发育过程中肾间质增多，肾实质比例减少，也使单位体积nNOS含量降低。总之在生后小鼠肾脏发育不同阶段，nNOS表达呈动态变化，这种变化不仅与其结构与功能发育相适应，而且还受自身所处环境影响。新生小鼠的肾脏nNOS表达含量最高，成年小鼠nNOS表达含量最低，这一趋势表明nNOS可能在生后小鼠肾脏发育的早期阶段起重要作用。
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2 Solhaug MJ, Dong X, Adelman RD, et al．Ontogeny of neuronal nitric oxide synthase，NOS 1，in the developing porcine kidney．Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol, 2000，278：1453～1459.
3 吕宇涛， 张艳， 秦石成，等．正常小儿肾脏血流阻力的研究．中华小儿外科杂志．2003，3：239～242.
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5 Majid DS，Navar LG．Nitric oxide in the control of renal hemodynamics and excretory function．Am J Hypertens．2001，14：745～825.
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