糖尿病大鼠心肌组织中caspase?8表达的研究
【摘要】 目的：研究糖尿病大鼠心肌组织中caspase?8表达与糖尿病发病机制的研究。方法：按体重将大鼠随机分为正常对照组(10只)和实验组(40只) ,各组大鼠禁食12h 后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射STZ溶液(0.1mol/ L、pH = 4.4 的构橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg/ml的STZ 溶液),正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液，观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。1周后,采尾血测血糖,以血糖浓度> 16.6mmol/ L ,饮水量> 40 ml/ d ,尿糖强阳性的大鼠作为糖尿病大鼠。6周后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学实验观察，将实验结果进行统计学分析。结果：正常对照组心肌细胞胞浆内无棕黄色颗粒沉积，Caspase?8表达弱；糖尿病组心肌细胞胞浆内棕黄色颗粒密集，Caspase?8呈阳性表达。图像分析结果显示：正常对照组心肌细胞内Caspase?8表达的平均光密度及阳性面积率分别为0.1157±0.0067、0.1208±0.01966，糖尿病组心肌细胞内Caspase?8表达的平均光密度及阳性面积率分别为0.3738±0.0045、0.3450±0.0241 。 正常对照组与糖尿病组之间平均光密度及阳性面积率差异有显著性意义(P<0.05)。
【关键词】 糖尿病； 心肌； caspase?8； 免疫组化
糖尿病( diabetes mellitus ,DM)是一组由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病群。作为一种常见病、多发病,其患病率正随人民生活水平的提高、人口老龄化、生活方式的改变而迅速增加,对人类健康有极大的威胁。DM发病逐年增多,已成为世界上继肿瘤、心血管病后第3位严重的慢性病［1］，因而早期发现、早期确诊、早期是决定糖尿病患者治疗效果及能否达到临床治愈的关键。本研究采用免疫组织化学方法观察了高血糖引起的心肌细胞的凋亡作用，旨在探讨和寻找治疗糖尿病和保护心肌的实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
昆明种SD大鼠30只,雄性,体重180～200g ,由武汉大学医学院实验动物中心提供,适应饲养1周后进行实验。
1.2 方法
1.2.1 动物模型建立及分组 按体重随机分为正常对照组(10只)和糖尿病组(20只) ,各组大鼠禁食12h 后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射 链脲佐菌(streptozotocin ,STZ)溶液(用0.1mol/ L、pH = 4.4 的构橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg/ml的STZ 溶液),正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液。观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。1周后,采尾血测血糖,以血糖浓度> 16.6mmol/ L ,饮水量> 40 ml/ d ,尿糖强阳性( + + + ～ + + + + )的大鼠作为糖尿病大鼠。然后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学实验。实验期间,密切观察动物进食和饮水量变化,每周称2次体重。
1.2.2 主要试剂 浓缩型兔抗鼠caspase?8 基因蛋白单克隆抗体盒(北京中山生物技术有限公司) ；超敏即用型S?P通用型免疫组织化学试剂盒(北京中山生物技术有限公司) ；显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。
1.2.3 主要仪器 YWY781型医用微波仪（250 W，50 Hz），浙江临安器材厂生产；家用高压锅。
1.2.4 常规HE染色 以上各组动物实验完毕后,将各组动物从心底部剪取心脏,切下心室。4%多聚甲醛固定、包埋、石蜡切片、HE染色。
1.2.5 免疫组织化学S?P法检测caspase?8相关抗原 主要步骤：①组织切片5 μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；②3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；③caspase?8采用微波抗原修复（3档，10 min）， PBS洗4×5min；④正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应；⑤一抗（Bcl?2，1: 150)37℃孵育1 h，PBS洗4×5min；⑥生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；⑦链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；⑧DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；⑨苏木精复染，脱水，透明，封片。
用PBS代替一抗作为阴性对照。
1.2.6 免疫组织化学结果判断 caspase?8以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反应物。 采用HPIAS?2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对caspase?8表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100％）。
1.3 统计学处理
对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK?q检验，检验水准α为0.05。
2 结果
2.1 光镜观察
正常对照组可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，细胞核呈椭圆形位于中央，胞浆内可见平行排列的肌原纤维，细胞轮廓清晰。糖尿病对照组细胞胞浆溶解呈空泡或网状，细胞界限模糊，可见心肌细胞断裂。
2.2 免疫组织化学结果
正常对照组心肌细胞胞浆内可见较少的棕黄色颗粒，caspase?8呈阴性表达；糖尿病组心肌细胞胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒，caspase?8表达呈强阳性。图像分析结果显示，正常对照组和糖尿病组平均光密度分别为0.1157±0.0067、0.3738±0.0045；正常对照组和糖尿病组阳性面积率分别为0.1208±0.0196、0.3450±0.0241。正常对照组与糖尿病组之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.05)，见表1。
表1 正常对照组与糖尿病组心肌细胞内Caspase?8表达的平均光密度和阳性面积率（略）
注：* 正常对照组与糖尿病组比较，P＜0.05。
3 讨论
糖尿病是目前临床学科中进展最迅速的学科之一。糖尿病患者在及世界范围内均呈迅速增多的趋势,目前全世界有糖尿病患者1.25 亿,我国糖尿病的患病率为2.51 %，预计2025 年糖尿病的患病率将达到14 %［2～4］。重度糖尿病及合并多脏器严重病变的患者尤为困难,若不积极防治,常常需截肢而致残,甚至导致死亡。因此防止糖尿病越来越引起广大医护人员及患者的关注。
糖尿病是一个多病因的综合病征，其发病原因主要与下列因素有关：遗传因素、肥胖、体力活动不足、饮食成份结构不合理、精神神经因素、病毒感染、自身免疫［5］。近年来,国内外许多学者经过临床和流行病学调查,以及周密设计的基础研究和实验研究,虽然对糖尿病的病因有了较多的认识,但对原发性糖尿病的病因仍然不清楚。有实验研究证明糖尿病性心肌病的特征性改变为间质改变和微血管改变。Karnafel［6］发现糖尿病性心肌病的病理改变有微血管变窄、微动脉瘤形成、心肌肥大、胶原结构改变、心肌纤维化及血管周的纤维化。在糖尿病性心肌病中,心脏功能改变有心绞痛、心力衰竭和心律失常,左心室舒张功能障碍是糖尿病性心肌病的早期标志之一［7］ 。Cai等［8］研究发现,高血糖可直接导致活体心肌细胞凋亡,高血糖导致的心肌细胞凋亡至少部分是通过细胞色素C 激活的caspase?3 途径的激活而控制。Cai 等报道在糖尿病患者和动物模型中都可观察到心肌细胞死亡,通过抗氧化剂或凋亡信号途径的特异性抑制剂抑制心肌细胞死亡,可以明显的阻止糖尿病的心脏毒性,因此心肌细胞死亡在糖尿病性心肌病变中有重要作用。
细胞凋亡( apop tosis)是基因控制的细胞自主性死亡。caspase ( cystine containing asparate specific protease)意为含半胱氨酸的天冬氨酸特异水解酶,是凋亡的主要执行者。已发现的14种caspase均以酶原(procaspase)形式合成并定位于细胞内不同的亚细胞部位。caspase分为3大类型:启动型、效应型和炎症型。启动型caspase包括caspase?2、?8、?9、?10,通过自身活化启动凋亡并调节效应型caspase;效应型caspase包括caspase?3、?6、?7,能分解细胞蛋白,执行凋亡;炎症型caspase包括caspase ?1、?4、?5 等。caspase的结构可分为前结构域(prodomain) ［9］大亚基和小亚基。在procaspase被切割为大、小两个片段(约20kDa和10kDa,分别为p20和p10)及一个N?端前区后,两大两小共4个片段聚合成为含有两个位点活化了的caspase。caspase?8 也称MACH、FL ICE、Mch5,1996年被克隆成功。caspase?8基因CASP8与c?FLIP ( cellular FLICE inhibitory protein)基因及caspase?10基因CASP10共同位于染色体2q33?34。caspase?8以无活性的酶原(procaspase?8)形式存在于成人及除胎儿脑组织外的各种组织中,在外周血白细胞中分布较高。在死亡受体( Fas、DR4和DR5等)介导的细胞凋亡途径中, caspase ?8是关键的启动型caspase。细胞外配体与细胞膜死亡受体( death recep tor,DR)结合后,适配蛋白(如FADD)作为平台供procaspase?8聚和并相互剪切。未活化时, procaspase?8的两个DED结构是结合在一起的。当细胞膜表面的Fas与其配体( FasL)或相应的抗体结合后,受体发生多聚化,引起FADD与受体胞浆区死亡结构域结合,这种结合使FADD的DED变构,变构后的DED与胞浆中procaspase?8的一个DED结合, procaspase?8的两个DED分开。procaspase?8的ICE同源区暴露后表现出蛋白酶活性并通过自身催化形成有活性的caspase?8。caspase是凋亡的主要执行者, caspase?8的活化是caspase级联反应的第一步。caspase?8与诸多疾病及损伤的病理变化有关。作为一个适宜的补充性检测指标, caspase?8的免疫组织化学证据不仅可检测组织损伤而且可望成为生活反应早期阶段的评价指标。有学者通过研究caspase?6、?7在细胞凋亡过程中表达的时间性以探讨推测皮肤损伤、愈合的时间［10］。caspase?8在细胞凋亡过程中表达的时间规律性也有可能用以推测皮肤损伤、愈合的时间。为进一步研究糖尿病对心脏毒性的作用，我们对糖尿病性心肌病变进行了组织学及免疫组织化学的观察，结果显示，caspase?8在正常对照组心肌细胞内呈阴性表达，而在糖尿病组中呈阳性表达。结果提示高血糖可直接导致活体心肌细胞凋亡,高血糖导致的心肌细胞凋亡至少部分是通过细胞色素C激活的caspase?3途径的激活而控制。其确切机制有待进一步研究。
【】
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