七氟醚预处理对缺血/ 再灌注心肌组织Bcl?2表达的影响
【摘要】 目的：探讨七氟醚预处理对缺血/ 再灌注心肌组织保护作用的机制。方法： 制备心肌缺血/ 再灌注损伤模型,将24只新西兰白兔随机分成对照组、缺血预处理组、七氟醚预处理组。实验完毕后，将各组动物心肌组织做组织切片,采用免疫组织化学方法观察各组动物心肌细胞内Bcl?2水平的表达,利用HPIAS?2000图像分析系统测定Bcl?2在以上3组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果: Bcl?2在缺血预处理组和七氟醚预处理组心肌细胞内的表达高于对照组, 差异有显著性( P<0. 05) ;缺血预处理组心肌细胞内Bcl?2表达水平与七氟醚预处理组相比，差异无显著性(P＞0.05)。结论：七氟醚预处理对缺血再灌注的在体兔心肌具有重要的保护作用。
【关键词】 七氟醚; 预处理; 再灌注损伤; 心肌
七氟醚是一种较新的吸入麻醉药,诱导迅速、刺激性小、溶解度低,并且吸收和清除迅速。近年来,有研究报道吸入麻醉药安氟醚、氟烷、异氟醚、七氟醚、地氟醚除了具有优良的麻醉作用外,还具有较好的心肌保护作用［1～3］ ，并且在动物实验中发现氟烷、安氟醚、异氟醚、地氟醚能模拟心肌预处理效应,减轻心肌缺血/ 再灌注损伤［4］,但尚未见有关七氟醚预处理对缺血/ 再灌注心肌组织Bcl?2表达的影响。我们采用免疫组织化学方法检测了七氟醚预处理对缺血/ 再灌注心肌组织Bcl?2表达的影响,进一步探讨七氟醚预处理对心肌缺血/ 再灌注损伤的影响及其可能的机制。
1 材料与方法
1.1 模型制备
选用健康新西兰白兔(3～3. 5kg) 24只,雌雄不限,肌注氯胺酮70 mg·kg-1 。颈部正中分离气管并切开插管,用DH2140动物呼吸机进行100%纯氧机械通气,控制呼气末二氧化碳分压在4～4.5 kPa之间。分离颈外静脉置20号管,持续滴注乳酸林格氏液20 ml·kg-1·h-1 ,必要时加少量碳酸氢钠以维持血液pH 值在7.35～7.45之间。麻醉维持用微量泵泵注咪唑安定0.05～0.1mg·kg-1·h-1 ,氯胺酮2～5 mg·kg-1·h-1和维库溴胺0.05～0. 1 mg·kg-1·h-1 。分离颈动脉,置22 号管连接换能器测压。正中劈开胸骨,切开心包,缝线绕过左冠状动脉前降支近端深面并用胶管将其套住。拉紧套管即阻断冠状动脉,表现为心肌局部青紫,心电图ST 段上升。放松套管,局部反应性充血,表明心肌再灌注。通过左心耳穿刺置入20 号管至左心室,并连接换能器测压。
1.2 实验分组
完成上述手术步骤后稳定30min ,将白兔随机分成对照组、缺血预处理组、七氟醚预处理组,每组8 只。对照组在45 min后阻断冠脉3h ,随后再灌3h。缺血预处理组先行3次每次5 min 的冠脉阻断,每两次之间再灌5min ,预处理后稳定20min ,然后阻断3h ,再灌3h。七氟醚组用麻醉机(ohmeda) 吸入2 %七氟醚30 min后,洗脱15min ,然后阻断冠脉3h ,再灌3h。其余步骤同对照组。加用吸入麻醉药的组在吸入麻醉药期间停用静脉麻醉药,以维持麻醉水平相对稳定。呼出气中二氧化碳和麻醉药浓度用麻醉气体监测仪(RGM5250 , England) 监测。以上各组动物实验完毕后,将各组动物从心底部剪取心脏,切下心室,进行标本制备。
1.3 主要试剂和仪器
1.3.1 主要试剂 即用型S?P通用型免疫组织化学试剂盒，DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）；浓缩型鼠抗兔Bcl?2单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）。
1.3.2 主要仪器 YWY781型医用微波仪（250 W，50 Hz），浙江临安器材厂生产；家用高压锅。
1.4 方法
免疫组织化学S?P法检测Bcl?2相关抗原主要步骤：5μm组织切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢处理10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，Bcl?2采用微波修复抗原，正常羊血清处理10min以减少非特异性背景，一抗4℃孵育过夜，生物素标记的二抗处理10min，链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物处理10min，DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应，苏木精复染，脱水、透明、封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组，已知阳性组织作为阳性对照。
1.5 免疫组织化学结果判断
Bcl?2以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，胞核和胞浆内无棕黄色反应物。
采用HPIAS?2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对Bcl?2抗原的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。
1.6 统计学处理
对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK?q检验，检验水准α为0.05。
2 结果
缺血预处理组心肌细胞胞浆内可见较多棕黄色颗粒,Bcl?2表达呈阳性；七氟醚预处理组心肌细胞胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒,Bcl?2表达呈强阳性；对照组心肌细胞胞浆内可见少量的棕黄色颗粒,Bcl?2表达弱。图像分析结果显示：缺血预处理组Bcl?2表达的平均光密度为0.3529，七氟醚预处理组Bcl?2表达的平均光密度为0.3834，对照组Bcl?2表达的平均光密度为0.1863。缺血预处理组Bcl?2表达的阳性面积率为0.2547，七氟醚预处理组Bcl?2表达的阳性面积率为0.2735，对照组Bcl?2表达的阳性面积率为0.0869。经单因素方差分析，组间有显著性差异（P＜0.01）。经q检验，缺血预处理组、七氟醚预处理组与对照组之间，Bcl?2的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（P＜0.01），缺血预处理组与七氟醚预处理组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性（P＞0.05），见表1。
表1 不同组Bcl?2表达的平均光密度和阳性面积率（略）
注： * 缺血预处理组与对照组比较，P＜0.05；# 对照组与七氟醚预处理组比较，P＜0.05；△ 七氟醚预处理组与缺血预处理组比较，P＞0.05。
3 讨论
局部组织或器官缺血将导致组织或器官的损害，但随着血供恢复，在随后的一定时间内组织或器官的损伤不仅不会减轻，反而逐渐加重，此即所谓的缺血再灌注损伤（ischemic reperfusion injury,IRI）。
自1977Hearse首次提出缺血再灌注损伤概念以来，已逐渐引起医学界的高度重视。大量动物实验显示，氧自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、血管内皮细胞、一氧化氮、中性粒细胞、细胞黏附分子和细胞凋亡等均可能参与再灌注损伤的发病过程。
目前虽然对缺血或缺血再灌注损伤的确切机制还不十分清楚,但巳经知道损伤的临床结局主要就是细胞死亡。细胞死亡有两种形式:一种是坏死,另一种是凋亡。凋亡(apoptosis) 是细胞在基因调控下的主动性死亡,不引起炎症反应。持续缺血和缺血再灌注时心肌组织都可发生细胞凋亡。已经证实,人类心肌梗死除细胞坏死外,细胞凋亡也参与了梗死的病理过程,细胞凋亡不仅影响梗死面积,而且促成心脏结构的重构,心肌梗死的早期和晚期均存在凋亡现象［8］。再灌注损伤引起的细胞凋亡多分布于短暂缺血后血管再通的相关部位和梗死灶的收缩带区域。有资料显示,心肌梗死急性期的存活心肌其Bcl?2 表达增加,而慢性期Bax表达增加,说明刺激因子由Bcl?2和Bax 基因产物来抑制或诱导存活的心肌细胞凋亡。细胞凋亡的基因调控是一个十分复杂的问题,尤其是相关基因的相互关系尚不十分清楚。缺血再灌注损伤对心肌组织的结构和功能的影响一直是研究的重点之一。心肌缺血预处理是目前最有效的心肌保护措施之一。因心肌缺血预处理的作用机制与受体(如腺苷受体) 、离子通道( KATP通道) 及酶类激活有关,于是药物性预适应便应运而生,即用药物诸如腺苷受体激动剂、KATP通道开放剂等可模拟缺血预处理效应,同样可获得明显的心肌保护作用。研究发现一些吸入麻醉亦具有药物性预适应效应［5，6］ ,在离体或体内动物心脏实验中显示出显著的心肌保护作用。
七氟醚是一种较新的吸入麻醉药,1968 年由Regan 合成,1971 年Willin 等最先报道并于1975 年对其理化性质、药理作用及毒进行了评价,1992 年始用于日本,1995 年经美国FDA 批准在美国上市。与其他吸入麻醉药相比,其优点是诱导迅速、刺激性小、溶解度低,并且吸收和清除迅速。七氟醚临床特点突出,其麻醉诱导迅速、麻醉维持平稳、苏醒快速完全,对心肌缺血和再灌注损伤有一定的保护作用,药物预处理对心肌缺血和再灌注损伤的保护作用是当今研究的热点之一,Garci将72 名接受冠脉搭桥术的患者随机分为七氟醚组(术前吸入4 %七氟醚10 min) 和安慰剂组(空气氧气混合气体) ,结果发现术后一年心脏事件的发生七氟醚组(3 %) 明显较安慰剂组低(17 %) (P=01038) ,且七氟醚组患者动脉活检显示血小板?内皮细胞粘附分子1(PECAM21) 显著减少(P=0. 019) ,过氧化氢酶表达显著增加(P=0. 001) ,提示七氟醚预处理可能对冠脉搭桥术后的患者有心肌保护作用,可能与一些前蛋白和抗保护蛋白表达的改变有关。另一项关于微创冠脉旁路移植术(MIDCAB) 中对照使用七氟醚和异丙酚的研究［7～10］也指出,对于冠状动脉缺血的病人,不论接受心脏或非心脏手术,七氟醚可能对心肌都有保护作用。
本研究结果表明：缺血预处理组心肌细胞Bcl?2表达呈阳性；七氟醚预处理组心肌细胞Bcl?2表达呈强阳性；对照组心肌细胞Bcl?2表达弱。经q 检验，缺血预处理组、七氟醚预处理组与对照组之间，Bcl?2的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（P＜0.01），缺血预处理组与七氟醚预处理组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性（P＞0.05）。结合这一结果，我们认为七氟醚预处理对缺血再灌注的心肌细胞的凋亡具有抑制作用，同时可促进心肌细胞的存活而达到对心肌细胞的保护作用。
七氟醚预处理的机制目前尚不清楚,可能与激活腺苷受体、抑制蛋白激酶C、开放胞浆和线粒体A TP 调节钾离子通道( KATP ) 、通过选择性的直接作用于凋亡蛋白合成、减少兴奋性神经递质尤其是兴奋性氨基酸的释放、减少铁离子摄取及稳定线粒体膜电位、诱导即早基因( immediate?early genes ,IEGs) 家族中的几种基因的表达等有关［11］。
【】
1 Michael CL , Menno T , Luis D , et al. Rapid Sevoflurane Induction Compared with Thiopental . Journal of Clinical Anest hesia , 2004，16 :271～275.
2 Kodaka M , Johansen JW , Sebel PS , et al.The Influence of Gender on Loss of Consciousness wit h Sevoflurane or Propofol . Anesth Analg , 2005，101 (2) :377～381.
3 Tomoki Nishiyama. Hemodynamic and catecholamine response to a rapid increase in isoflurane or sevoflurane concent ration during a maintenance phase of anest hesia in humans. J Anest h ,2005，19 :213～217.
4 Robert D , Eugene B , Ann G, et al . Tracheal Extubation of Deeply Anest hetized Pediat ric Patient s : A Comparison of Desflurane and Sevoflurane. Anest h Analg , 2003，96 (5) : 1320～1324.
5 Redfield MM , J acobsen S J , Burnett JC , et al . Burden of systolic and diastolic vent ricular dysfunction in t he community : appreciating the scope of the heart failure epidemic. JAMA ,2003，289 :194～202.
6 Payne RS , Akca O , Roewer N , et al . Sevoflurane?induced preconditioning protects against cerebral ischemic neuronal damage in rat s. Brain Res ,2005 ,1034 :147～152.
7 Kapinya KJ , Lowl D , Futterer C , et al . Tolerance against ischemic neuronal injury can be induced by volatile anest hetics and is inducible NO synthase dependent.St roke ,2002 ,33 :1889～1898.
8 Kehl F , Payne RS , Roewer N , et al . Sevoflurane?induced preconditioning of rat brain in vitro and the role of KATP channels.Brain Res ,2004 ,1021 :76～81.
9 Matei G, Pavlik R , McCadden T , et al . Sevoflurane improves elect rophysiological recovery of rat hippocampal slice CA1 pyramidal neurons after hypoxia. J Neurosurg Anest hesiol ,2002 ,14 :293～298.
10 Moe MC , Ber Johnsen J , Larsen GA ,et al . The effect of isoflurane and sevoflurane on cerebrocortical presynaptic Ca2+ and protein kinase Cactivity. J Neurosurg Anest hesiol ,2003 ,15 :209～214.
11 Engelhard K, Werner C , Eberspacher E ,et al . Sevoflurane and propofol influence the expression of apoptosis2regulating proteins after cerebral ischaemia and reperfusion in rats. Eur J Anaesthesiol ,2004 ,21 :530～537.
