LRP16基因启动子活性分析
作者：卢学春，楼方定，韩为东，朱旭东，
母义明，徐周敏，于力
【摘要】 本研究的目的在于分析LRP16基因不同启动子区域的活性，为深入研究LRP16基因的表达调控机制奠定基础。在NCBI的人类基因组数据库中截取并下载LRP16基因转录起始位点5’侧翼区2.7 kb的基因组序列，设计PCR引物，从健康外周血单个核细胞中克隆和亚克隆了LRP16基因的启动子分子，对各个长度相差400 bp左右的亚克隆启动子片段调控荧光素酶表达的作用强度进行比较分析。结果获得了与GeneBank序列一致、长度为2.6 kb的 LRP16基因启动子DNA序列，其主要调控序列在LRP16基因转录起始位点5’侧翼区的-200至-600 bp。结论： LRP16基因启动子是一个典型的Ⅱ型启动子，其启动子活性在-200至-600 bp区域最强。
【关键词】 基因表达
Analysis of LRP16 Gene Promoter Activity
Abstract The study was aimed to analyze the characteristics of LRP16 gene promoter and its activity in order to explore the possible regulation mechanism of LRP16 gene expression. A 2.6 kb genomic DNA sequence of LRP16 5’-end was obtained from NCBI by BLAST software. The 7 target sequences between 0.2-2.6 kb from a healthy blood donor DNA sample were amplified by PCR，then identified by DNA sequencing and semi-nest PCR. The verified sequences were analyzed on-line. The results showed that the 7 target sequences were about 400 bp different from each other. All 7 sequences were the same to these GenBank described. At last，all 7 promoter sequences were ligated with luciferase vector，and then the luciferase activity was analyzed in HeLa cells. A known gene promoter sequence can be freely obtained from NCBI database. It is concluded that LRP16 promoter is a standard typeⅡpromoter and its activity is strongest in the region from -200 to -600 bp.
Key words LRP16 gene；promoter；gene expression
LRP16基因是于力等利用限制性酶切基因扫描（restriction landmark genomic scanning，RLGS）和 cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA end，RACE)技术克隆到的一条白血病相关基因 ［1-3］。该基因定位于第11号染色体长臂11区，其编码的基因翻译产物是一种核蛋白。此外通过SAGE（serial analysis of gene expression）数据库分析还发现，LRP16基因在多种性激素相关的肿瘤中均有高表达［4］，提示LRP16基因与肿瘤发生密切相关。通过在乳腺癌细胞系中的研究发现，LRP16基因是一个雌激素受体β调控的下游基因［5］，作为进一步研究LRP16基因表达调控、活性及其生物学作用的前期工作，我们克隆了LRP16基因启动子，并对LRP16基因启动子区域近2.7 kb的DNA序列进行了分析。
材料和方法
主要试剂与仪器
FPROGO2D型PCR仪（Technol Cambridge Ltd.公司产品）。质粒提取试剂盒（Wizard? Plus Minipreps DNA Purification System产品），PCR产物回收试剂盒（Wizard? PCR Preps DNA Purification System产品），大肠杆菌感受态细胞（E.Coli Competent Cells）和ITPG以及X-Gal均为Promega公司产品。Tryptone和Yeast extract（OXOID Ltd产品）。淋巴细胞分离液（天津TBD产品），LA Taq酶（TaKaRa Co. 产品），琼脂糖凝胶（Spanish产品）。T4 DNA连接酶，p-GEM-T Easy Vector，Superfect? transfection reagent，TD-20/20型Luminometer荧光素酶检测仪。
人类基因组DNA的提取及引物设计
选用健康献血员的外周血分离单个核细胞，常规方法提取基因组DNA，并用HindIII DNA酶切处理。
LRP16启动子及亚克隆启动子序列钓取及引物设计
LRP16启动子、亚克隆启动子序列的钓取 以LRP16基因cDNA序列全长作为探针，在NCBI(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Human Genomic Database(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)中利用Blast程序进行搜索，下载并截取LRP16基因5’ 侧翼2.7 kb基因组DNA序列。
引物设计 利用Primer软件包设计9个上游引物和1个下游引物（上海生工生物工程公司合成），其中每个亚克隆启动子的序列长度相差0.4 kb左右，引物名称和序列如下（括号内数字表示的是扩增产物长度，字母表示酶切位点，相对应的PCR产物分别为S0-S6）：
LRP16基因启动子-荧光素酶报道重组子的构建
采用上述引物扩增出7条3’ 端平齐，5’ 端不等大小相差200 bp左右的启动子和亚克隆启动子DNA片段，将此片段克隆纯化并插入pGL3-Basic质粒构建7个LRP16基因启动子和亚克隆启动子荧光素酶载体，具体操作方法详见〖6，7］。
启动子及亚克隆启动子荧光素酶活性检测
采用脂质体转染法，用Superfect? transfection reagent将上述构建好的7个LRP16基因启动子-和亚克隆启动子-荧光素酶报道重组子转染入HeLa细胞，培养24小时后，用TD-20/20型Luminometer荧光素酶检测仪检测细胞内的荧光素酶活性，以荧光素酶活性的高低作为启动子活性大小的指标。
结 果
LRP16基因启动子及亚克隆启动子序列的钓取
通过上游引物Pu0和下游引物Pd进行PCR扩增之后共得到7条长度相差0.4 kb左右大小的PCR产物，图1为S0-S6 PCR产物结果。
序列检测
结果表明各亚克隆片段与目标序列的理论序列完全一致，限于文章篇幅以下仅给出S0的DNA测序结果。S0长度为2.6 kb，经用DNAstar软件比较，该序列与人类基因组序列完全一致（图2）。
pGL3-S0－pGL3-S6的酶切鉴定
构建好的7个质粒pGL3-S0－pGL3-S6经SacⅠ和Hind Ⅲ内切酶酶切以后，产物分别为1个相同大小的载体片段和7个大小彼此相差约200 bp的启动子DNA片段，证实了所构建好的启动子-荧光素酶质粒分别为7个大小不等的亚克隆启动子-荧光素酶载体（图3）。
LRP16基因启动子及亚克隆启动子荧光素酶活性检测
LRP16基因启动子能够调控荧光素酶的表达，其中pGL3-S5的调控作用最强，表明在ORF上游-1 bp至-600 bp范围内存在LRP16的核心调控序列，对表达起主要调控作用。除pGL3-5和pGL3-S4以外，pGL3-S1是另一个相对活性较高的亚克隆启动子区域，但与前两者相比pGL3-S1的作用相对比较弱，不起主要调控作用。在pGL3-S1和pGL3-S4之间的pGL3-S3和pGL3-S2，对荧光素酶表达调控作用明显弱于上游的pGL3-S4和下游的pGL3-S1（所有检测结果均是将本底荧光强度去除之后的相对荧光强度数值）（图4）。
讨 论
LRP16基因是通过RLGS技术对初治和复发白血病筛查之后得到的一个白血病复发相关基因。我们通过生物信息学方法对LRP16基因启动子区进行了预测，发现该基因是一个雌激素受体调控的下游基因，并通过试验得到了证实［5］，由此不难看出，LRP16基因除了与白血病复发密切相关以外，还与乳腺癌密切相关，因此，有必要对LRP16基因的表达调控进行深入研究。作为该基因启动子调控研究的前期工作，我们克隆LRP16基因启动子序列，并对启动子不同片段所具有的相对转录活性进行了分析。
通过基因组测序结果分析，我们选取LRP16基因转录起始位点上游2.6 kb长度的基因组DNA序列作为启动子目标序列。为了便于扩增2.6 kb长度的DNA序列，首先将人类基因组DNA用限制性内切酶Hind III处理（在整个LRP16启动子2.6 kb内，没有HindIII酶切位点），然后以高保真的LA Taq酶进行PCR扩增。这样，一方面能够快速达到长距离PCR扩增的目的，另一方面又能减少PCR扩增产物的突变，DNA测序结果证实了这一点。
在对LRP16基因启动子区DNA序列测定证实以后，首先对1 kb范围内的顺式结构进行了分析，结果发现LRP16基因启动子是一个典型的II型启动子，在-25位具有一个序列为GTAAATAAGG的禽C-型LTR TATA 盒，在TATA盒的上游，即在 -186和-174之间有一个序列为CCCGGGCGGGCGC的GC盒［8］。进一步的启动子活性分析发现，LRP16基因启动子的转录活性在-200至-600 bp之间最强［7］。由于启动子调控除核心启动子不依赖于反式作用元件调控以外，增强子的存在对表达的强度也至关重要。故这一段序列中可能存在对LRP16基因表达调控至关重要的增强子和起主要调控作用的顺式作用元件，为此我们正在用生物信息学方法对该片段可能存在的增强子和顺式作用元件做进一步分析，为深入研究LRP16基因的功能和表达调控机制提供依据。
总之，LRP16基因启动子是一个典型的II型RNA聚合酶启动子，其主要调控序列存在于-200至-600 bp之间的区域。
【】
1于力，韩为东，楼方定等. 新的白血病相关基因LRP16的克隆. 军医进修学院学报，2000；21:81-84
2韩为东，于力，楼方定等. RACE技术在钓取白血病相关基因LRP16全长cDNA中的应用. 实验血液学杂志，2001；9: 18-21
3韩为东，楼方定，于力等. LRP16编码蛋白质的信息学分析及其细胞内内定位的实验研究. 军医进修学院学报，，2002；23: 281-284
4韩为东，于力，楼方定等. 一个新的白血病相关基因LRP16全长cDNA的克隆、序列分析及表达特征. 中国生物化学与分子生物学报，2001；17:209-214
5Han WD，Mu YM，Lu XC，et al. Up-regulation of LRP16 mRNA by 17beta-estradiol through activation of estrogen receptor alpha (ERalpha)，but not ERbeta，and promotion of human breast cancer MCF-7 cell proliferation: a preliminary report. Endocr Relat Cancer，2003；10: 217-224
6卢学春，楼方定，韩为东等. LRP16基因启动子的克隆及荧光素酶报道重组子的构建. 军事医学院院刊，2003；27: 19-21
7卢学春，楼方定，韩为东等. LRP16基因启动子的亚克隆及表达调控载体的构建. 军医进修学院学报，2003；24：141-143
8卢学春，楼方定，于力等. LRP16基因启动子克隆及特征分析. 生物技术通讯，2003；14：20-22
