非清髓造血干细胞移植后致敏供者淋巴细胞输注对嵌合状态及GVHD影响的实验研究
作者：陈宝安，张琰，丁家华，毕延智，赵刚，高冲，孙耘玉，孙雪梅，王骏，陈宁娜，程坚
【摘要】 本研究目的是探讨经受者皮肤致敏后的异基因供者淋巴细胞输注（DLI）是否能在促进形成完全供者嵌合（CC）的同时减轻移植物抗宿主病（GVHD）。以C57BL/6小鼠（H-2b，B6）为受者，于第0天接受60Co γ线全身照射（TBI），总剂量为5.5 Gy，照射当天移植经粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员后的BALB/c小鼠（H-2d，BA）外周血干细胞（2×107个），移植后第2天腹腔注射环磷酰胺200 mg/kg，并分别于移植后第28天输注致敏/未致敏的供者淋巴细胞2×106。结果显示，致敏后DLI的受鼠（黑色）无1例出现GVHD，60天时转变为完全供者嵌合，表型明显呈现为供鼠（白色）特征，CD4+/CD8+T淋巴细胞比值在DLI后早期下降，半月后有所升高，但仍低于正常水平；未致敏的DLI受鼠出现不同程度的GVHD，嵌合率稍有上升，仍表现为混合嵌合体（MC），CD4+/CD8+比值在DLI后早期升高，后期降至正常水平。结论：经受者皮肤致敏后的DLI在诱导CC的同时降低GVHD发病率，CD4+/CD8+比值与GVHD发病率间具有良好的相关性。
【关键词】 非清髓性异基因造血干细胞移植
Effects of Sensitized Donor Lymphocyte Infusion on the Chimerism and Graft-versus-Host Disease after Nonmyeloablative Allogeneic Stem Cell Transplantation
Abstract To explore whether the complete donor chimerism could be achieved and graft-versus-host disease could be alleviated by donor lymphocyte infusion which was sensitized by the skin of the recipient，female C57BL/6 mice (H-2b，B6) as recipients received total body irradiation (TBI) of 5.5 Gy (60Co γ-ray) on day 0 followed by allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT). The allo-grafts consisted of 2×107 peripheral hematopoietic stem cells from mobilized male BALB/c (H-2d) donor mice with the granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF). Day 2 after allo-HSCT，the recipient mice were given 200 mg/kg cyclophosphamide intraperitoneally. Afterwards these recipient mice were infused 2×106 sensitized or unsensitized-donor lymphocytes at the 28 days after transplantation. The results showed that the mice receiving sensitized-donor lymphocyte infusion did not suffer from GVHD and the phenotypic character of the recipient mice (black color) converted to that of the donor mice (white color)，and to become full-donor chimerism. It was found that the ratio 0f CD4+/CD8+ T lymphocytes of them decreased at the earlier period and increased after half month，but which were also lower than that of the normal value. While various grades of acute GVHD was observed in that of the control group and the mixed-chimeras were maintained，though it increased a little，and the ratio of CD4+/CD8+ T lymphocytes increased at first，then decreased to the normal level half month later. It is concluded that sensitized DLI converted mixed to comlete donor chimerism without GVHD，and the rate of CD4+/CD8+ has close relation to the incidence of GVHD.
Key words nonmyeloablative allogeneic hematopoietic stem cell transplantation；donor lymphocyte infusion；chimerism；graft-versus-host disease
J Exp Hematol 2006；14(1):102-106
异基因外周造血干细胞移植(allo-HSCT)是恶性血液病的重要手段，特别是近年来随着非清髓性SCT的开展，给更多的血液病患者带来了希望。非清髓性移植以较低强度的预处理诱导受者的免疫耐受，使得供者细胞植入并形成混合嵌合体，减少了移植相关并发症和相关死亡。由于混合嵌合体的移植物抗白血病(GVL)作用较弱［1，2］，且随着嵌合率的逐渐下降，移植后复发率明显增高，故在其基础上进行供者淋巴细胞输注(DLI)，对加强GVL效应，降低疾病复发率，提高无病生存期具有重要临床意义。GVHD作为DLI后的主要并发症，明显限制了DLI的临床应用，探索一种既避免GVHD而又不损害GVL效应的方法成为目前国内外学者关注的热点之一。本研究探讨C57BL/6小鼠经非清髓性异基因外周造血干细胞移植后，输注经受鼠皮肤致敏后的供者淋巴细胞对于嵌合状态及GVHD发病率的影响，同时检测DLI后T细胞亚群的变化，以评价CD4/CD8比值与GVHD之间的相关性。
材料和方法
动物
受鼠为清洁级雌性C57BL/6小鼠(H-2b，B6)，由医学院实验动物研究所提供，8-10周龄，体重16.7×1.4 g；供鼠为清洁级雄性BALB/c小鼠(H-2d)，由扬州大学畜牧兽医学院提供，均饲养于东南大学医学院SPF级动物房内，饲料及垫料均经辐照消毒，饮用高压消毒无菌水。
试剂及器材
环磷酰胺（CTX，200毫克/支，上海华联制药有限公司产品），重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF，75微克/支，上海三维生物技术有限公司产品），单克隆荧光抗体（FITC anti-mouse CD3、CD4、CD8，25微克/支，杭州联科公司代理的美国Caltag公司产品），全血样本DNA抽提试剂盒（晶美公司代理的美国Gentra公司产品），60Co放疗机（中国核动力研究设计院GWGT80型60Co远距离治疗机，南京市第二人民提供帮助），流式细胞仪(美国Beckman-coulter公司产品)。
供鼠外周血动员及干细胞悬液的制备
BALB/c小鼠于移植前4天起给予250 μg/kg G-CSF，皮下注射，每日1次，末次注射2-3小时后在无菌条件下经内龇静脉取血，置入含EDTA的抗凝管中，利用淋巴细胞分离液(Ficoll-hypaque液，比重1.077，20℃)水平离心30分钟，400×g，提取单个核细胞，然后用0.01 mmol/L的PBS液漂洗2次后重悬细胞并调节细胞浓度至8×107/ml。
异基因干细胞移植
受鼠移植前6天开始饮用含红霉素（250 mg/L）和庆大霉素（320 mg/L）的无菌水，并持续至移植后2周。移植当日将受鼠置于清洁级包装的塑料盒内接受60Co γ射线5.5 Gy全身照射(TBI)，剂量率167.68 cGy/min，照射后4小时内经尾静脉输注供鼠PBMNC 2×107个，移植后第2天予CTX 200 mg/kg腹腔注射。
供鼠淋巴细胞制备
移植后第1天起取B6小鼠背部皮肤1 cm×1 cm，埋入供鼠皮内，切口局部缝合。每周1次×4周，以致敏供鼠。第28天致敏与未致敏的供鼠分别经内龇静脉采血后以Ficoll分离淋巴细胞（分离方法同干细胞采集），用0.01 mmol/L的PBS液重悬细胞并调节细胞浓度至8×106/ml。操作均在无菌条件下进行。
实验分组设计
移植后每3天采血计数白细胞、称量体重，同时观察小鼠状态，排除死亡小鼠，待第21天造血恢复，体重稳步回升后将22只受鼠随机分为3组。A组：单纯移植组（n=6）；B组：第28天回输2×106个未致敏供鼠淋巴细胞（n=8）；C组：第28天回输2×106个致敏后供鼠淋巴细胞（n=8）。同时设预处理对照组，观察造血恢复及表型变化。所有受鼠均未给予GVHD防止措施。
GVHD主要观察指标
移植后每日观察小鼠体重、体形、体位、毛发、腹泻等，记录存活期，存活时间超过60天者为长期存活。每3天称量体重。死亡小鼠取肝脏、脾脏、小肠和爪垫皮肤组织大体形态观察后置于10%福尔马林液中固定保存，集中包埋、切片，HE染色后光学显微镜下观察，判断GVHD情况。
异基因嵌合体的测定
于移植后第21、60、90天分别经内眦静脉取各组小鼠外周血250 μl，EDTA抗凝后，应用Genomic DNA Purification试剂盒提取DNA，保存于-20℃。PCR扩增：输入雌性B6小鼠体内的雄性BALB/c小鼠造血干细胞带有Y染色体特有的性别决定基因(SRY基因)。SRY引物用DNAStar软件设计，由上海生工生物工程公司合成，上游引物序列为5′TGGTGTGGTCCCGTGGTGAGAG3′，下游引物序列为5′GATGGCATGTGGGTTCCTGTCC3′，扩增产物为296 bp，以BALB/C的DNA扩增产物为参照。PCR反应体系：10×PCR缓冲液5 μl，25 mmol/L MgCl2 5 μl，dNTPs 1 μl，10 μmol／L上游及下游引物各0.5 μl，DNA模板2 μl，TaqDNA聚合酶0.5 U（上海申能博采公司提供），补足双蒸水至50 μl。扩增条件：95℃预变性5分钟，95℃变性60秒，60℃退火60秒，72℃延伸1分钟，循环39次，末次循环后72℃再延伸10分钟。产物检测：扩增产物在含0.5 mmol／L溴乙锭的2％琼脂糖凝胶中以4-5 V/cm电压降电泳30-45分钟，于Image Master VDS凝胶扫描仪上成像。用Totallab v2.01凝胶图像分析软件进行半定量分析，所有B6小鼠扩增产物的光密度均以BALB/c为基准较正，以B6/BA表示嵌合率。
T细胞亚群测定
移植后第45、60天分别取各组小鼠外周血50μl（EDTA抗凝），加入10 μl的直标单克隆抗体于室温下放置10分钟，再加入50 μl的溶血剂静置10分钟后加入2ml的蒸流水室温放置10分钟，然后以300×g离心5分钟，加0.5ml的PBS后上机检测CD3+、CD4+、CD8+细胞数。
统计学处理
采用SPSS 11.O专业软件进行分析，数据以x±SD表示，行方差分析、t检验。
结 果
存活期
A组及C组小鼠体重均稳步上升，无1例死亡，长期存活率100%；B组小鼠输注未致敏的供者淋巴细胞后，3只小鼠在输注半月内死亡，长期存活率62.5%。A、C组小鼠存活时间均较B组明显延长（P<0.05）。
GVHD发生情况
B组小鼠行未致敏DLI后均出现不同程度的弓背体位、翘毛、体重下降、消瘦、精神萎靡、腹泻等表现（图1），3只小鼠在输注后半月内死亡。病理检查符合GVHD表现： ①肝脏：肝细胞空泡样变，汇管区内有大量淋巴细胞浸润，可见灶状出血；②脾脏：萎缩，巢状结构破坏，可见大量散在浸润的淋巴细胞、出血坏死灶及含铁血黄素的沉积；③小肠：肠粘膜水肿出血，固有层和基层有淋巴细胞浸润；④皮肤：厚薄不均，真皮层内可见淋巴细胞浸润、胶原纤维肿胀。与移植后未回输淋巴细胞前死于GVHD小鼠的尸解结果一致。C组小鼠无1例出现GVHD表现，体重稳步上升，精神状态良好。
表型变化及嵌合体检测结果
B、C组小鼠于移植后第35天开始逐渐呈现出供鼠的表型，以C组小鼠变化明显（图2），移植后90天已完全转变为供鼠表型特征。A、B、C组小鼠在移植后21天时均检测到混合嵌合体，目的基因表达率分别为31.247±4.337，30.880±4.118，30.608±4.064， 各组间差异无显著性；60、90天时A组均未检测到嵌合体，B组仍为混合嵌合体，表达率分别为58.767±13.683和58.579±13.01，C组60天则转变为完全供者嵌合，90天时维持不变，各组间比较差异具有显著性（P<0.05）。
T淋巴细胞亚群
如图3、4及附表所示，DLI后早期(45天 )CD4/CD8比值在B组中明显升高，而C组显著降低，各组间比较差异有显著性（P<0.05），且C组CD8+细胞数明显升高，与其它各组比较有显著性差异（P<0.05）；半月后B组（60天）CD4/CD8比值下降，与正常及预处理对照组间差异无显著性，C组CD4/CD8虽有所上升，仍低于其它各组，差异具有显著性（P<0.05）。
讨 论
DLI作为一种过继性免疫疗法通过促进完全供者嵌合体、加强GVL效应，在预防与移植后复发病例中发挥了重要作用［3，4］。由于DLI后存在有致死性GVHD及骨髓衰竭等严重并发症，故目前大量的实验研究集中于如何降低DLI后的GVHD发病率。抑制受体抗原呈递细胞，导入自杀基因、阻断B7-CD28途径、选择性去除供体同种异体反应性T细胞等多种方法均处于实验阶段。
大量试验证实，通过亚致死剂量γ射线照射结合CTX可以建立小鼠骨髓移植的混合嵌合体模型，我们在此基础上，以G-CSF动员后的供鼠外周血干细胞回输，在主要组织相容性复合体（MHC）完全错配的两种近交系C57BL/6与BALB/c小鼠间成功地建立了非清髓性外周血干细胞移植的混合嵌合体模型，然后回输经受鼠皮肤致敏过的供者淋巴细胞，诱导形成了完全供者嵌合体，同时无GVHD的发生，而未经任何处理的DLI组仍保持混合嵌合状态，且出现了不同程度的GVHD，生存期较致敏后DLI组明显缩短。这与George等［5］在MHC配型相同的犬类非清髓移植模型中，通过受者皮肤（次要组织相容性抗原差异）致敏供者后进行DLI诱导了完全嵌合体（CC）形成的同时降低GVHD发病率的结果相一致。另外Junghanss等［6］以混合嵌合体受者肾脏致敏供者后行DLI亦促进了CC的形成，且无排斥反应的发生。Slavin等［7］将供者的外周淋巴细胞与受者父母外周血淋巴细胞共孵育后回输治疗移植后复发病例取得了良好的临床效果，获得了稳定持久CC的同时未观察到GVHD的发生。
免疫供者淋巴细胞后回输明显优于直接回输，对于促进完全嵌合状态的转变及降低GVHD的发病率具有重要意义，这种作用的可能机制是：①受者组织（除造血组织外）表达MHCⅠ类抗原，可以提供T细胞激活所需要的第一信号，在致敏过程中，其表面可受到多种细胞因子的作用而表达MHCⅡ类抗原，为T细胞的活化提供第二信号，通过间接途径加速了致敏物的排斥反应。诱导产生的记忆性T细胞输入受者体内，接触非应激状态下仅表达MHCⅠ类抗原的组织细胞后，由于缺乏共刺激信号而诱导了免疫无能，对受者组织的攻击性下降，从而降低了GVHD发病率［6］。造血细胞与其他组织细胞间存在抗原性的差异，特别是小鼠，仅骨髓源性的细胞表达MHCⅡ类抗原，可迅速激活已致敏的记忆性T细胞，从而打破了原有的免疫耐受，促进了CC的形成；②移植排斥与耐受是一个复杂的体内过程，致敏物中的可溶性抗原、反复致敏过程中激活的T细胞本身及其所释放的多种细胞因子可激活体液免疫，从而参与免疫耐受的形成。致敏过程中可溶性抗原刺激产生的封闭抗体及T细胞的抗独特型等可能在致敏后DLI受鼠GVHD发病率降低过程中发挥了一定的作用。其确切机制尚有待进一步探讨。
在移植后发挥作用的T细胞亚群主要为CD4+的Th1/Th2及CD8+的Tc1/Tc2，其中CD4+细胞通过“细胞因子风暴”始动了GVHD的病理过程，而Th2及Tc2亚群在移植后发挥GVL及抗病毒感染、调节GVHD上发挥了重要作用［8，9］。本实验中对各组的T细胞亚群进行监测，存在明显差异，致敏后DLI组早期CD8+细胞数增高，CD4+/CD8+下调；未致敏DLI组早期以CD4+细胞增高明显，CD4+/CD8+升高；后期致敏后DLI组CD4+/CD8+虽有所上升，但仍低于正常对照，差异有显著性，且DLI后两组小鼠的免疫重建均明显优于单纯移植组。CD4+/CD8+比值的变化在一定程度上反应了受者的耐受状态，这与赵振林等［10］在T细胞疫苗免疫前后CD4+、CD8+T细胞变化的研究结果相一致。致敏后DLI组CD4+/CD8+比值的变化反应了B6小鼠对供者较高的耐受性，与较低的GVHD发病率间具有良好的相关性。
【】
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