蛋白酶体抑制剂PS-341对多发性骨髓瘤骨髓间充质干细胞多种细胞因子表达的影响
作者：林如峰，陆化，刘澎，沈文怡，张建富，吴雨洁，费小明，李建勇
【摘要】 为了探讨蛋白酶体抑制剂PS-341(bortezomib，velcade)对多发性骨髓瘤（MM）患者间充质干细胞（MSC）细胞因子分泌的影响，用含10% FBS的RPMI 1640培养液培养11例MM患者MSC，细胞数达5-10×105时以终浓度50 nmol/L的PS-341作用4小时，用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测IL-6、IL-1β、SCF细胞因子表达。结果表明： PS-341作用后MM病人MSC细胞因子的表达有显著下降，IL-6、IL-1β、SCF的表达与对照组比较，其显著性检验结果分别为P<0.05、P<0.01、P<0.05，其中 IL-1β尤为明显；难治复发组与缓解组比较，IL-1β的表达有显著差异，完全缓解（CR）组IL-1β表达受抑制更明显，IL-6、SCF两组间表达无明显差异；PS-341的1例患者MSC在PS-341作用后IL-1β未见表达；IL-1β的表达与否对IL-6、SCF的表达无影响。结论： 蛋白酶体抑制剂PS-341下调MM患者MSC IL-6、IL-1β、SCF细胞因子的表达。
【关键词】 多发性骨髓瘤
Effects of Proteasome Inhibitor PS-341 on the Multiple Cytokine Expressions of Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow in Patients with Multiple Myeloma
Abstract To explore the effects of proteasome inhibitor PS-341 on the cytokine expressions of mesenchymal stem cells (MSC) in patients with multiple myeloma（MM），MSCs of 11 patients were cultured in medium of RPMI 1640 containing 10% FBS. When cells grew to 5×105-1×106，cells were exposed to 50 nmol/L PS-341 for 4 hours，then harvested. The expressions of IL-6，IL-1β and SCF were detected by RT-PCR. The results indicated that after treatment with PS-341 the expressions of IL-6，IL-1β and SCF of MSCs decreased markedly，especially that of IL-1β，compared with control (P<0.05、P<0.01、P<0.05，respectively). There were obviously differences of IL-1β expression between refractory/relapsed group and complete remission（CR）group and IL-1β expression was inhibited more seriously in CR group，whereas there were no significant differences of IL-6 and SCF expression between two groups；IL-1β expression of patients treated with PS-341 was not detected；there were not effects of IL-1β expression on expressions of IL-6 and SCF. It is concluded that proteasome inhibitor PS-341 downregulated the expressions of IL-6，IL-1β and SCF of MSCs in patients with MM .
Key words proteasome inhibitor PS-341；multiple myeloma；mesenchymal stem cell；interlukin-6；interlukin-1β；stem cell factor
实验已经证实，骨髓微环境对多发性骨髓瘤（MM）细胞的生存、增殖有重要作用［1］。针对骨髓微环境的靶向治疗已成为MM治疗研究的热点之一，并取得了良好的效果。间充质干细胞（MSC）是构成骨髓微环境的重要成员，分泌的细胞因子在MM细胞的归巢、生存、增殖和耐药中起重要作用［2，3］。PS-341（bortezomib，velcade）是二类靶向治疗药物，通过作用骨髓瘤细胞和微环境抑制瘤细胞生长，诱导凋亡，对难治复发和耐药病人也有效［4］。本研究旨在探讨PS-341在治疗MM时对MSC有何影响以及了解MSC是否参与了PS-341对MM骨髓微环境的靶向治疗机制。
材料和方法
标本来源及主要试剂
骨髓间充质干细胞来自住院或门诊MM患者骨髓，实验组共11例，其中CR 3例，难治6例（包括1例PS-341治疗后患者），复发2例，生理盐水替代药物干预的患者标本设为对照组，共10例。PS-341购自Millenuim Pharniaceuticals，Inc，USA，淋巴细胞分离液（比重为1.077）为上海生化二厂生产，RPMI 1640培养液为Gibco公司产品，胎牛血清购自HyClone公司，RNA抽提液Tripure为Roche生产，IL-6、IL-1β、SCF及β-actin引物为上海生物工程技术有限公司合成。
MSC的采集、分离与培养
无菌抽取骨髓15-20 ml，肝素抗凝，1×PBS 1∶1稀释后缓慢加入淋巴细胞分离液中，800×g离心30分钟，取中间单个核细胞层置于另一离心管中，PBS洗涤2次，RPMI 1640培养液吹打细胞成悬液，种植于含10% FBS的RPMI 1640培养液中，置于5% CO2、 37℃培养箱培养，待细胞贴壁后更换培养液，以后3-4天换液1次，待细胞数达5×105-1×106时进入下一步实验。
实验分组
实验设对照组及实验组。对照组不加药物干预，只加等量生理盐水；实验组11例加PS-341，用0.9%生理盐水溶解蛋白酶体抑制剂PS-341，以终浓度50 nmol/L作用于MSC 4小时，0.25%胰蛋白酶消化离心并制成细胞悬液1 ml，方法参见〖5］。
细胞总RNA提取
细胞悬液置于EP管离心，弃上清，Tripure充分裂解细胞，按该试剂提供的提取步骤抽提RNA，紫外分光光度计测浓度并行RNA电泳。
RT-PCR
按Premega公司提供操作步骤进行。总RNA 1 μg，oligo(dT)1 μl，70℃预热5分钟后冰水浴5分钟，加AMV酶10 U，25 mmol/L Mg2+ 2 μl，10×buffer 5 μl，加DEPC水至总体积25 μl，42℃水浴1小时，95℃水浴5分钟，冰水浴5分钟，-20℃保存。cDNA 2?5 μl，10 μmol/L上下游引物各2.0 μl，10 mmol/l dNTP 1 μl，DNA聚合酶5 U，25 mmol/L Mg2+ 2 μl，10×buffer 5 μl，各细胞因子的反应条件及引物序列见表1和表2。取PCR产物5 μl 1.5%琼脂糖凝胶电泳35分钟，紫外光下观察结果、拍照并行灰度分析。PCR的条件及引物的序列分别见表1和表2。Tabel 1. PCR conditions for detection of β-actin IL-6，IL-1β and SCF in MSC from patients of MM（略）Tabel 2. Primer sequences used in RT-PCR to detect cytokine expressions in MSC from patients with MM（略）
统计学处理
实验结果用均数±标准差（x ±SD）表示，所得数据用SPSS 12.0 for windons 软件分析，t检验，P＜0.05为差异有显著意义。
结果
PS-341对MM患者MSC的 IL-6、IL-1β、SCF细胞因子的表达均有显著影响，与未经PS-341作用的对照组比，3种细胞因子的表达都明显下降，IL-6、IL-1β、SCF细胞因子的表达与对照组比较P值分别是P<0.05、P<0.01、P<0.05。电泳图及灰度分析结果分别见附图和表3。其中以IL-1β表达下降最为明显（P<0.01），2例标本未见目的条带（1例为完全缓解患者，1例为PS-341过的患者）；与难治复发组比较，完全缓解病人MSC IL-1β表达显著下降，有统计学意义；1例接受过PS-341治疗的患者其MSC在PS-341干预后未见IL-1β表达，与治疗前比较明显受抑制。实验组IL-6、SCF细胞因子的表达较对照组低，有显著差异，完全缓解、难治复发患者间无明显差别。IL-1β表达阴性的标本与阳性标本比较，IL-6、SCF的表达无显著差异。Tabel 3. Results of PCR product electrophoresis analysed by software of Labworks 4.0（略）
讨论
多发性骨髓瘤（MM）是异常浆细胞单克隆恶性增生性疾病，目前无法治愈。对MM发病机制的深入研究认识到，MM细胞赖以生存的骨髓微环境在ＭＭ疾病的发生、中有着相当重要的地位，针对骨髓微环境的靶向治疗已成为MM治疗的新的重要手段，这种疗法对难治、复发及耐药的患者具有良好的效果［6.7］。代表第一类靶位治疗药物的沙利度胺通过抑制骨髓血管新生和调节细胞因子等作用进一步改善了MM的预后，有力证明了干预骨髓微环境可能成为治愈MM的途径之一［8］。
蛋白酶体抑制剂PS-341代表了骨髓微环境靶位治疗的第二类药物，取得了良好的抗肿瘤效果。研究表明，PS-341可作用于MM细胞和骨髓微环境，通过抑制泛素-蛋白酶体途径抑制转录因子NF-κB的活性和稳定细胞周期调节蛋白，从而抑制骨髓瘤细胞黏附和细胞增殖，诱导瘤细胞凋亡［9］，其中抑制IL-6的分泌是PS-341靶位治疗MM的重要机制。目前PS-341作用机制的研究主要集中在蛋白酶体依赖的信号通路和对肿瘤细胞的直接影响［10］，而对与ＭＭ细胞的归巢、生存、增殖、凋亡及耐药等生物学特性有重要关系的MSC的研究未见报道，本研究通过查明MSC在PS-341治疗MM中的作用进一步了解PS-341的作用机制，以利于临床应用。
我们以终浓度50 nmol/L的PS-341(bortezomib)作用MSC 4小时后发现，IL-6、IL-1β、SCF细胞因子的表达明显降低。这些因子都已被实验证实是MM疾病发生、发展的重要调节因子。实验观察到对IL-1β表达的抑制尤为明显，完全缓解及用PS-341治疗过的MM患者再用PS-341干预后，其MSC几乎不表达IL-1β。IL-1β是骨髓瘤细胞生长繁殖的重要调节因子，可刺激MSC分泌IL-6和多种黏附分子，促进细胞黏附、增殖、耐药和抗凋亡，并有独特的破骨细胞作用，95%以上的MM细胞可检测到此因子表达。研究者们认为这是区别其他浆细胞病的重要指标［11，12］；实验也发现IL-1β抗体能有效抑制MM细胞的增殖［11］。我们的研究发现，PS-341对MSC IL-1β的抑制十分明显，鉴于IL-1β在MM疾病中的重要作用，可以认为抑制MSC IL-1β的分泌是PS-341有效抗MM的重要机制之一。骨质损害是MM的临床特征之一，是疾病预后判断的重要指标，而IL-1β是与之关系最密切的细胞因子［11］，所以PS-341有可能有效治疗MM的骨质损害，改善疾病的预后，值得临床进一步研究。与难治复发病人比较，完全缓解以及用PS-341治疗过的MM患者，其MSC IL-1β的表达受PS-341的抑制更为明显，这间接证明了IL-1β与MM疾病进展关系密切，因此有必要对PS-341治疗残留疾病的效果进行更多探讨。实验观察到，接受PS-341治疗后的MSC用PS-341再次作用后未见IL-β表达，这提示PS-341对IL-1β的药理作用可能有累加性，但由于例数少，无统计意义。
IL-6被认为是与MM细胞生物学特性关系最密切的细胞因子，下调IL-6的表达是靶位治疗MM的基础。已经报道PS-341可抑制MM细胞及基质细胞IL-6的表达［13］，我们的研究表明，PS-341抑制 MSC IL-6的表达并不依赖MM细胞与BMSC之间的相互作用，CR组和难治复发组无显著差异。文献报道IL-1β可促进IL-6的分泌［11］，我们实验发现，MSC IL-1β表达水平的高低不影响IL-6及SCF细胞因子的表达，这是否与PS-341对MSC作用机制的不同以及MSC本身特异性有关，值得实验进一步证实。SCF与瘤细胞的增殖和抗凋亡有关［3］，我们发现PS-341对SCF也有明显抑制作用，这可部分解释MM患者接受PS-341治疗后出现全血细胞减少的临床表现。可见PS-341除了作用于蛋白酶体以外，MM患者MSC亦为其治疗的重要靶点之一，多位点的治疗机制为PS-341有效抗MM提供依据和可能，对其作用机制的逐步阐明有助于更有效运用PS-341治疗MM。
总之，PS-341明显抑制MSC细胞因子的表达，是PS-341有效治疗MM的机制之一。对难治复发的患者也有明显效果。我们实验虽然证实了影响MSC细胞因子的表达是PS-341靶向治疗MM的机制之一，但MSC具体如何参与PS-341靶向治疗MM目前还不清楚，其作用机制可能更为复杂丰富，有待进一步研究。
【文献】
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