几种双向凝胶电泳蛋白质检测方法的比较
作者：秦慧，刘霆，柳斌，宋鑫，黄欣，杨金亮，赵霞，魏于全
【摘要】 本研究对蛋白质染色法进行比较和分析，以求获得满足蛋白质组研究所需的适宜的蛋白质检测法。实验采用2-D电泳分离急性早幼粒白血病细胞株NB4的全蛋白及1-D电泳分离蛋白质分子量标准物，从蛋白质检测的灵敏性、质谱兼容性、操作的简便性等角度，比较了传统考马斯亮蓝染色法、胶体考马斯亮蓝染色法、改良考马斯亮蓝染色法和银染法4种蛋白质着色法对凝胶分离蛋白质的检测影响，探讨了影响蛋白质染色与鉴定的影响因素。结果显示，银染检测灵敏度最高，但质谱鉴定相容性差，鉴定率近10%；改良考马斯亮蓝染色法检测灵敏度也高，可达4 ng/spot，质谱鉴定率可接近55%。结论： 改良考马斯亮蓝染色法的蛋白质检测灵敏度高，与质谱兼容好，能满足蛋白质组研究需要。
【关键词】 蛋白质组
Abstract The aim of this study was to compare and analyze protein staining in order to select the optimal staining method for proteomic research. Proteins from acute promyelocytic leukemia cell line NB4 and protein molecular weight marker were separated respectively by 2-D or 1-D electrophoresis and detected respectively by the typical Coomassie brilliant blue，the colloidal Coomassie brilliant blue，the modified Coomassie brilliant blue and the silver staining protocols. The protein detection sensitivity，compatibility with mass spectrometry (MS) and facility of the four staining protocols were compared. The results indicated that the silver staining exhibited the highest sensitivity and MS showed the lowest compatibility 10% of protein identification rate. The detection sensitivity of the modified Coomassie brilliant blue staining was superior to that of other two Coomassie brilliant blue stainings，close to but lower than the silver staining，however the compatibility with MS was better （protein identification rate about 55%）. It is concluded that the protein detection sensitivity of the modified Coomassie brilliant blue staining is high，and its compatibility with MS is better，this modified Coomassie brilliant blue staining is an optimal staining method for proteomic research.
Key words proteomics；two-dimensional gel electrophoresis；protein detection；Coomassie brilliant blue staining；silver staining
蛋白质组研究要求有高分辨率的蛋白质分离及准确、灵敏的质谱鉴定技术。凝胶电泳中蛋白质的着色不仅影响蛋白质分离的分辨率，同时也影响后续的质谱鉴定。选择适当的蛋白质染色法将有助于提高蛋白质组学研究结果的质量。蛋白质的染色常用的有4类：有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。其中有机试剂染色以考马斯亮蓝染色法（Coomasie brilliant blue，CBB）为代表，在蛋白质分析中常用，但对低丰度蛋白质的显现较差；银染灵敏度虽高，却常与质谱不兼容；荧光染色以SYPRO试剂为主，蛋白质检测灵敏度高，能兼容质谱，但由于需要配备特殊的检测仪器及试剂的昂贵，未被作为常规方法使用；而同位素显色则存在安全性和操作局限性等问题［1-4］。因此，筛选简便、节约、检测灵敏度高、质谱兼容的蛋白质着色法是蛋白质组研究所需。由于考马斯亮蓝染色法的广泛运用，近年来就考马斯亮蓝染色法在提高其灵敏性方面研究者们作了许多改进，方法众多，评价不一 ［5-7］。我们在作双向凝胶电泳时，将常用的几种考马斯亮蓝染色
法及银染进行了比较，并就其染色影响因素作出分析。
材料和方法
试剂
固相pH梯度干胶条（IPG strip pH3-10NL，IPG strip pH5-8，17cm）、urea、CHAPS、TBP、DTT、Bio-Lyte 3/10 Ampholyte、IAM、SDS、Tris、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、CBB-G250均为BIO-RAD公司产品。硫酸铵及磷酸均购自成都科龙试剂厂。AgNO3为Sigma公司出品。Protein molecular weight marker #SW0431为MBI公司出品。甲醛、Na2S2O3 与Na2CO3分别为成都天华科技股份有限公司、重庆北碚化学试剂厂和天津市塘沽鹏达化工厂产品。
仪器
IPGphor等电聚焦仪、proTEANⅡ垂直电泳仪、Power PAC1000电泳仪、加样溶胀槽、GS-800 Calibrated Densitometer扫描仪、PDQuest凝胶图像分析软件均为BIO-RAD公司产品。
细胞总蛋白质的提取
取4份经常规培养的急性早幼粒白血病细胞株（NB4）1×107细胞各重悬于350 μl蛋白质裂解缓冲液中（8 mol/L Urea，2 g/L CHAPS，2 mmol/L TBP，2 ml/L Carrier Ampholyte，痕量溴酚兰），置冰浴中超声裂解，静置30分钟，15 500×g离心30分钟，取上清，进行蛋白质定量。
单向定量电泳
取蛋白质分子量标准物，第一次按1∶2稀释后，以后按1∶3倍比例逐级稀释，经4级稀释后，取15 μl上样液上样，β-半乳糖苷酶上样量依次分别为1 μg、0.24 μg、0.062 μg、0.0156 μg、0.004 μg。作12 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶单向电泳，同时电泳4份胶，显色以确定染色灵敏度。
双向电泳
取300 μl样品液沿水化盘中槽的边缘自左向右线性加入，将17 cm IPG胶条胶面朝下置于槽中，静置45分钟后覆盖矿物油，在20℃溶胀11-16小时。溶胀后的胶条置于等电聚焦盘中，在Protean IEF Cell中进行等电聚焦，温度设置为20℃，电压模式设置为:快速升压，250 V，0.5小时；500 V，0.5小时；10 000 V，60 000 Vh（伏特×小时）。取IEF后的IPG 胶条，先后分别置于含DTT平衡液1（6 mol/L urea，2 g/L SDS，0.05 mol/L Tris pH 8.8，200 ml/L gylcecol，2 g/L）及含碘乙酰胺平衡液2（同平衡液1，但其中DTT换为2.5 g/L 碘乙酰胺）中轻微摇荡各10分钟。将平衡好的IPG 胶条置于预先灌制的12 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，封固，在15℃低温水循环条件下，15 mA/gel电泳15分钟，然后以25 mA/gel恒流电泳。
显色
取出SDS-聚丙烯酰胺凝胶，经超纯水清洗2次，每次1分钟，4块胶分别按4种不同的染色方法显色。下列每步操作皆在摇床上进行。4种染色法成份组成及操作如下： ①传统考马斯亮蓝染色法：清洗后的凝胶经固定液（45.4%甲醇、4.6%乙酸）固定1小时，随后用染色液（45.4%甲醇、4.6%乙酸、0.1% CBB G250）着色过夜，再经洗脱液（5%甲醇、7.5%乙酸）过夜脱色至背景清晰。②胶体考马斯亮蓝染色法（colloidal Coomassie brilliant blue，cCBB）染色法［5］：凝胶先经超纯水漂洗后，再用colloidal Coomassie blue G250染色液（1.6%磷酸、8%硫酸铵、0?02% CBB G250、20%乙醇）着色过夜，洗脱液为超纯水，换液3-4次直至背景清晰。③改良考马斯亮蓝染色法（modified Coomassie brilliant blue，mCBB）染色法［6］；操作方法同胶体考马斯亮蓝染色法，只是染色液组成不同（0.12% CBB G250、10%硫酸铵、10%磷酸、20%乙醇），着色1小时即可。④银染（silver staining）［2］：凝胶漂洗后先被固定液（50%甲醇 + 5%乙酸）固定1小时，随后分别用50%甲醇和超纯水清洗各10分钟，0.02 mg/L Na2S2O3 致敏1分钟，超纯水清洗2次，每次1分钟，再用预冷的0?15% AgNO3着色20分钟，超纯水再次清洗2次，每次1分钟，2% Na2CO3 + 0.04% 甲醛显色20-30秒，当溶液变黄以后除去，换新鲜的溶液后继续显色直至显色适度后，以5%乙酸终止显色。
成像、分析、质谱鉴定
脱色后，凝胶经GS-800 Calibrated Densitometer扫描成像，用PDQuest软件进行分析。切取蛋白质点，胰酶消化，行质谱鉴定。
结 果
4种染色法的蛋白质检测灵敏性分析
β-半乳糖苷酶的上样量（箭头所示）依次分别为1、0.24、0.062、0.0156和0.004 μg。经传统考马斯亮蓝染色后的条带在62 ng水平隐隐可见（图1a）；而胶体考马斯亮蓝染色法的灵敏度稍高，62 ng条带明显可见（图1b）；改良考马斯亮蓝染色法的效果更好些，在15.6 ng水平可见条带的显示（图1c）；而银染法灵敏度最高，在15.6 ng水平可见清晰条带的显现，同时在4 ng可见隐约条带（图1d）。4种染色法的比较显示，灵敏度最高的是银染法，可达纳克级水平，其次为改良考马斯亮蓝染色法，10纳克级蛋白质能被检测。而胶体考马斯亮蓝染色法和经典考马斯亮蓝染色法稍差，检测水平仅达几十纳克。
4种染色法的双向电泳蛋白质点显示比较
图2为来自NB4细胞的全蛋白经pH 3-10NL的等电点梯度分离，SDS-PAGE 二维垂直电泳后被3种考染法着色成像的显示。可以看出传统考马斯亮蓝染色法的蛋白质点显现最少（图2a），胶体考马斯亮蓝染色法的蛋白质点显现较多（图2b），而改良考马斯亮蓝染色法的蛋白质点显现更多（图2c）。凝胶背景以后二者为更清晰。经PDQuest软件进行分析，3幅图的蛋白质点显现数分别为483、679、890。图3为NB4细胞的全蛋白经pH 5-8 IPG分离，分别经改良考马斯亮蓝染色法（图3a）与银染法（图3b）着色成像的蛋白点显示。二者上样量一致，蛋白点的显现数量相当，但银染的蛋白点明显显示着色重。这与单向电泳的效果相同。
4种染色法的可操作性比较
在比较其蛋白质检测灵敏性的同时，对染色法的操作简便性、安全性以及蛋白质经质谱鉴定的成功率也作了对比。附表比较显示，考马斯亮蓝染方法简便，但耗时较长，经改进后可以做到无毒操作，质谱兼容性较高。银染步骤繁多，但耗时短；操作过程中有甲醇、甲醛等毒性物的接触，质谱兼容性低。即使我们选择的银染法被报道为质谱兼容的，但仍然表现为低的蛋白鉴定率，不及考马斯亮蓝染。Table . Comparison of the four protein staining protocols（略）
讨 论
凝胶染色方法对蛋白质分辨率的影响
提高双向凝胶电泳的分辨率是蛋白质组学研究尚待解决的课题及技术方向，影响蛋白质分辨率的因素较多，其中凝胶染色方法对蛋白质分辨率的影响不可忽视，它影响了实验的显像结果，直接干预了后续的质谱鉴定。目前，在蛋白质组学领域中广泛应用的是考马斯亮蓝染色法和银染法两种。
考马斯亮蓝（Coomassie brilliant blue，CBB G-250）的化学名称为二甲花青亮蓝，偏酸性，与蛋白质的碱性基团结合，颜色由棕黄色转为深兰色。考马斯亮蓝染色法可以达到微克级检测水平，着色程度与蛋白量的线性动力学相关范围广，适合定量分析。该法由于较低的成本、使用方便及与下游的质谱鉴定技术的良好相容性，而得到了非常广泛的使用［6］。然而微克级的检测水平使它漏检了相当多的低丰度蛋白质，日益成为蛋白质组学的瓶颈，因此大量提高染色灵敏度的研究及各种染色液的配方和方法应运而生，经文献报道的方法众多，评价不一。我们的试验选择了3种常用的考马斯亮蓝染色法进行比较，测得传统考马斯亮蓝染色法的灵敏度可达几百纳克，胶体考马斯亮蓝染色法能检测到几十纳克蛋白，改良考马斯亮蓝染色法则可达几纳克蛋白水平。考马斯亮蓝染色法经过改进能获得高的蛋白质检测灵敏度，甚至可与银染媲美。
银染法是利用银离子与氨基酸共价结合，还原剂的加入使与胶内蛋白质结合的银离子形成金属银而显色。文献报道检测限度可低于1 ng的蛋白质，其灵敏度比传统考马斯亮蓝染色法高约100倍，被广泛应用于蛋白质组学研究，但银染步骤复杂，繁琐，且着色线性动力学的覆盖范围窄，导致蛋白质差异显示的不准确性，同时由于游离银离子及相关试剂的存在，给后续分析及鉴定带来一定的实际困难［2］。我们的实验只采用了一种银染法，结果显示银染法的灵敏性高于所有考马斯亮蓝染色法，4 ng的蛋白质条带也能显现，但蛋白质鉴定成功率低。
蛋白质检测灵敏度的影响因素
蛋白质着色显示的灵敏性既取决于染色试剂，如上述分析，又与染色过程中涉及的有机溶剂及离子有关。在考马斯亮蓝染色法和银染法中都存在如甲醇、乙醇、乙酸、甲醛等有机溶剂的使用。甲醇和乙醇在染色里起固定作用，把蛋白质固定在凝胶中或阻滞它们在凝胶中扩散。同时也去除电泳过程中遗留的干扰染色过程的物质，如去垢剂、还原剂和缓冲液等成分。乙酸的作用既是辅助固定蛋白质同时又维持染液的酸性度，以利于考马斯亮蓝与蛋白质结合。他们的存在有利于获得背景清晰、信噪比高的图像。由于3种有机溶剂的相似作用，我们在胶体考马斯亮蓝染色法及改良考马斯亮蓝染色法里，保留乙醇作为唯一的固定清洁剂，用磷酸替代乙酸发挥酸化作用，结果显示两种考马斯亮蓝染色法获得的图像背景比传统考马斯亮蓝染色法的要清晰，条带也锐利。
在胶体考马斯亮蓝染色法中，酸性的乙醇介质中加入硫酸铵，使得着色剂形成胶体染色颗粒，胶本身可不被显著着色，蛋白染色灵敏度得以提高［5］。而在改良考马斯亮蓝染色法中，在高酸、高离子环境下，蛋白质的葡糖胺和天冬酰胺酸质子化，更利于与染色剂发生结合［6］。因此2种染色法呈现出背景清晰、蛋白检测多的图像，且在改良考马斯亮蓝染色法中由于高酸、高离子存在，灵敏度出现提高，几接近银染水平。
甲醛在银染中发挥还原剂作用，使结合在蛋白质上的银还原而显色。甲醛浓度影响银染效果，浓度一般为400-500 μl/L。甲醛浓度较高时胶颜色发黄，背景色混杂，难以发现目的点；浓度较低不仅染色时间延长，而且不易着色。银的络合剂硫代硫酸钠防止自由银离子还原为金属银，可减少非特异染色，降低背景染色，其浓度一般为0.1-0.2 mg/L。该络合剂用量过多，胶颜色过深；少则不足以螯合掉游离的银离子，胶颜色发黑。
质谱兼容性的影响因素
考马斯亮蓝 G-250在一定的pH时，这种染料-蛋白质复合物被完全解聚。适应于蛋白质的质谱鉴定；而银染使用的银离子及醛类造成肽间的相互交连，影响胶内蛋白质酶解及洗脱，降低了蛋白质质谱分析的氨基酸序列覆盖率［6］，考马斯亮蓝染蛋白质鉴定的成功率在60％-80％之间，远高于银染鉴定的成功率（30％-60％）；而我们的结果是，前者的质谱鉴定成功率为50%，后者仅为5%。鉴于此，我们也在不断地寻找新的方法，以提高银染鉴定的成功率。
操作的安全性与简便性
由于有机溶剂的相似作用，我们在改进的考马斯亮蓝染色法里，抛弃有毒的甲醇及气味难闻的乙酸，同时在步骤上，我们采用染色和固定一步法进行，减少了第一步固定的时间，仅用超纯水清洗，缩短了整个染色及人与有毒物接触的时间。结果显示，两种考马斯亮蓝染色法获得的图像背景不比传统考马斯亮蓝染色法差。
通过我们的摸索及比较分析认为，用低毒的乙醇替代甲醇，采用高酸、高离子、快速而简便的改良考马斯亮蓝染色法能获得低背景、高灵敏度、兼容质谱的蛋白质显示，能为蛋白质组研究、双向凝胶电泳技术的蛋白质分析提供质量的保证。
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