急性髓系白血病82例患者VEGF与MMP-2、MMP-9的相关性研究
作者：杨琳，董作仁，温树鹏，潘崚，张学军，罗建民，徐世荣
【摘要】 为了探讨急性髓系白血病（AML）患者中血管内皮生长因子（VEGF）与基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的相互关系及二者在AML中的意义，采用半定量RT-PCR技术检测AML患者与正常人骨髓单个核细胞(MNC) MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA、VEGF mRNA的表达，用明胶酶谱的方法测定原代MNC和HL-60细胞分泌的 MMP-2、MMP-9的活性，应用ELISA方法检测AML患者血清中VEGF蛋白的水平，分析VEGF和MMP-2、MMP-9 mRNA之间的关系。结果显示：AML患者MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA与VEGF mRNA的表达和VEGF蛋白水平呈正相关，缓解期患者和正常对照无相关性；VEGF阳性组发生髓外浸润率明显高于阴性组；VEGF上调HL-60细胞中bcl-2的表达。结论：AML患者中MMP-2，MMP-9的表达和VEGF具有正相关性，VEGF可以上调部分AML患者中MMP-2，MMP-9的表达，VEGF可能与MMP-2，MMP-9共同参与了白血病髓外浸润的发生。
【关键词】 急性髓系白血病
Relationship between VEGF and MMP-2，MMP-9 in 82 Patients with Acute Myeloid Leukemia
Abstract In order to investigate the relationship between VEGF and matrix metalloproteinase (MMP)-2，-9 in acute myeloid leukemia patients，and evaluate the significance of them in extramedullary leukemic invasion，the expressions of MMP-2 mRNA，MMP-9 mRNA，VEGF mRNA in bone marrow from 86 patients with acute myeloid leukemia (AML)，as well as human hematopoietic cell lines were analyzed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The proteolytic activities of MMP-2 and MMP-9 in the supernatants were measured by zymography. The VEGF protein in serum of all samples was detected by ELISA. All these results were analyzed for determination of the relationship between VEGF and MMP-2，MMP-9. The results showed that there was a positive correlation between expressions of MMP-2 mRNA or MMP-9 mRNA and VEGF mRNA or protein. But no such correlation was demonstrated in the AML (CR) and normal control (NC) groups. A higher expression level of MMP-2 and MMP-9 in the VEGF positive group was found，as compared with the negative group (P<0.05). More extramedullary infiltration occured in VEGF positive groups than that in VEGF negative groups of AML. The expression of bcl-2 in HL-60 cells was upregulated by VEGF. It is concluded that there are significantly positive correlations between the expression of MMP-2 and MMP-9 with VEGF mRNA or protein levels in AML patients. VEGF can upregulate the expression of MMP-2，MMP-9 in HL-60 and a part of the primary leukemic cells. VEGF and MMP-2，MMP-9 may participate in the extramedullary leukemic invasion of AML patients.
Key words acute；myeloid；leukemia；VEGF；MMP-2；MMP-9；regulation
有关VEGF与MMP关系的研究始于血管内皮细胞与血管新生方面，VEGF能促进血管内皮细胞的增殖与迁移，还可以诱导其产生MMP-2等降解细胞外基质的酶，为血管新生打开通道，它几乎参与了所有有血管新生的病理生理过程［1］，而抗VEGF R2的抗体可以减少内皮细胞中MMP-9的产生。近年来发现，MMP-2，MMP-9与VEGF在某些类型的白血病中也有类似关系［2］，它们可能协同参与了白血病髓外浸润。我们通过检测AML患者骨髓单个核细胞的MMP-2，MMP-9与VEGF的表达情况，探讨 AML 患者 VEGF 与 MMP-2，MMP-9 的相互关系，分析其与临床病理的意义。
材料和方法
病例
86例急性髓系白血病患者(包括50例初治患者、15例复发患者和21例缓解患者)，15名健康正常人。患者均为我院血液内科2001年10月-2003年1月期间住院和门诊随访的病人，均符合FAB诊断标准［3］，其中M1 1例、M2 16例、M3 27例、M4 22例、M5 19例、M6 1例。男47例，女39例，中位年龄为32（14-64岁）。15例正常人中男9例，女6例，中位年龄35（18-55岁）。
白血病细胞系
白血病细胞系HL-60由天津血液病研究所引进。
主要试剂
TRIzoL、M-MLV逆转录酶、Taq DNA聚合酶及MMP-2，MMP-9，VEGF121，GAPDH引物由上海生工生物公司提供。RPMI 1640培养液购自HyClone公司，重组人VEGF121购自美国公司，定量人VEGF.ELISA试剂盒购自上海森雄公司。
分组设计
将研究对象分为AML组（包括初治和复发AML患者）、缓解组（CR患者）、正常对照组。观察各组中MMP-2，MMP-9与VEGF的表达情况，分析其相关性。根据VEGF mRNA表达与否将AML组分为VEGF阳性组和VEGF阴性组，观察其中MMP-2，MMP-9的表达有无差异。从AML组中随机选取18例患者（包括复发患者2例）做骨髓原代细胞培养，检测其上清中MMP-2，MMP-9的活性与各自mRNA水平之间有无相关性。在培养体系中加入重组人VEGF121，观察其对细胞和MMP-2，MMP-9活性的影响。
逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）
从恒量的细胞中用TrizoL提取细胞总RNA。用随机六聚引物合成cDNA：2 μg总RNA在15 μl反应体积，42℃条件下逆转录90分钟。MMP-2、VEGF、MMP-9和GAPDH引物设计与扩增参照〖1］。VEGF上游引物：5′-TCGGGCCTCCGAAACCATGA -3′；下游引物：5′-CCTGGAGAGAGATCTGGTTC-3′，扩增片段长度是474 bp。MMP-2 上游引物：5′-GGCCCTGTCACTCCTGAGAT-3′；下游引物：5′-GGCATCCAGGTTATCGGGGA-3′，扩增片段长度是516 bp。MMP-9 上游引物：5′-CAACATCACCTATTGGATCC-3′；下游引物：5′-CGGGTGTAG AGTCTC TCGCT-3′GAPDH，扩增片段长度是649 bp。GAPDH上游引物：5′-CGGAGTCAACGG ATTTGGTCG ATA-3′；下游引物：5′-AGCCTTCTC CATGGTTGGTGAACAC-3′，扩增片段长度是374 bp。15 g/L ％琼脂糖凝胶电泳（含溴化乙啶5 μg/ml），结果在读胶仪Eagle EyeⅡ上扫描定量，以MMP/GAPDH和VEGF/GAPDH代表MMP和VEGF的相对表达量。
含底物的不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
细胞孵育 无菌条件下所取原代细胞（预先无血清培养过夜，以排除血清的作用）以5×106/L的接种密度接种于RPMI 1640培养液（无血清）中，每位患者培养2瓶，其中1瓶加入重组人VEGF121，终浓度为50 ng/ml，另1瓶作为对照。将上述细胞培养24小时后，收集上清用于检测VEGF和MMP的水平，细胞用于提取总RNA。取HL-60细胞株及随机抽取的3例AML原代细胞，以1×105/ml的密度分别接种于含有RPMI 1640培养液的24孔板中，加或不加新生牛血清（终浓度为5％，V/V）、VEGF121（终浓度为50 ng/ml），每种情况重复3孔，做长时间培养以观察VEGF对细胞的作用。
明胶酶活性分析 取上清液经不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶(分离胶浓度为8％，其中含0.02 g/L明胶，浓缩胶浓度为5％)电泳分离。电泳后的凝胶于2.5％ Triton X-100溶液中在摇床上低速摇动以洗脱SDS，使酶蛋白复性。2小时后将凝胶置于孵育液（含50 mmol/L Tris/HCl pH 8.0，50 mmol/L NaCl，10 mmol/L CaCl2）中，37℃孵育12小时。考马斯亮蓝染色4小时，脱色2小时，有MMP的位置将在蓝色背景下呈现白色清晰条带。用adobe photoshop软件分析：根据“酶的相对活性＝条带面积（像素）×（平均灰度值－背景灰度值）/255”的公式MMP-2，MMP-9的相对活性。
ELISA方法测定血清或培养上清中的VEGF水平
所有操作均按照ELISA试剂盒的操作说明进行。
方案
初治AML（M3除外）患者采用DA方案（阿糖胞苷、柔红霉素）化疗诱导缓解。复发AML患者分别采用AME（阿糖胞苷、米托蒽醌、足叶乙甙）、IA（阿糖胞苷、去甲氧柔红霉素）等方案。M3患者采用全反式维甲酸（ATRA）或以ATRA为主，联合应用小剂量DA、HA（阿糖胞苷、高三尖杉酯碱）方案诱导分化或ATRA加As2O3（三氧化二砷）治疗，复发M3应用As2O3治疗或标准化疗。
髓外浸润标准
出现下列情况之一时定为髓外浸润组：①经病证实为髓外浸润；②临床上有肝、脾、淋巴结肿大、皮肤结节、牙龈增生等髓外浸润体征，经过抗白血病治疗后缓解或明显好转；③胸片、B超等客观检查发现髓外浸润、可以排除其它病因且经过抗白血病治疗后缓解或明显好转；④根据我国诊断标准［3］诊断为中枢神经系统白血病。
统计学处理
采用SPSS 10.0统计软件分析处理。
结 果
MMP-2、MMP-9在AML中的表达及其与VEGF的相关性分析
AML组中MMP-2 mRNA 表达率（64.6%）和平均表达水平（0.531）均高于正常对照组，而MMP-9 mRNA表达率（44.6%）和平均表达水平（0.337）与正常对照无显著性差异。AML组中MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA与VEGF mRNA和VEGF蛋白水平明显正相关。缓解组和正常对照组MMP-9 mRNA 、MMP-2 mRNA与VEGF mRNA和VEGF蛋白水平均无相关性（表1，表2）。
Table 1. Correlation between the expressions of VEGF and MMP-2，MMP-9 mRNA in AML patients（略）Table 2. Correlation between the expressions of VEGF and MMP-2，MMP-9 mRNA in normal control
（略）
MMP-2，MMP-9在VEGF阳性组与阴性组中表达的差异
MMP-2在VEGF阳性组中表达率为74.2%，平均表达水平0.664，阴性组中表达率55.9％，平均表达水平0.522，其表达率在两组之间无显著差异(P＝
0.100），而在VEGF阳性组的平均表达水平高于VEGF阴性组(P＝0.041)。
MMP-9在VEGF阳性组中表达率(58.1％)和平均表达水平(0.522) 均高于VEGF阴性组表达率(32.4％) (P＝0.033）和平均表达水平(0.168) (P＝0.004）。
VEGF121对AML细胞和HL-60细胞株MMP-2，MMP-9表达的作用
未加VEGF121的原代细胞中的MMP-2的mRNA的阳性率为55.6％（10/18），平均水平为0.435，酶活性的阳性率为55.6％（10/18），平均水平为65.7。MMP-9的mRNA阳性率为50％（9/18），平均水平为0.420，酶活性的阳性率为50％（9/18），平均水平为191.97。二者的酶活性和mRNA水平具有明显的相关关系。
培养24小时后，比较加入了VEGF121的HL-60细胞和对照细胞中MMP-2，MMP-9的mRNA和酶活性的平均水平，结果显示： VEGF121组的 HL-60细胞中MMP-2和MMP-9 mRNA的表达水平分别比对照组提高了0.287和0.329（图1），培养Lane 4:MMP-9 (without VEGF)基中的酶活性也较对照组升高。在VEGF121组的原代细胞中MMP-2酶活性比对照组升高了11.0（P＝0.045），MMP-2，MMP-9的mRNA水平和MMP-9的酶活性较对照有所升高，但均无统计学显著差异（表3，表4）。进一步分析发现，VEGF121仅能促进部分原代细胞表达MMP-2或MMP-9，另一部分细胞则对VEGF121没有明显反应（图2，图3）。Table 3. Effect of VEGF121 on expression of MMP-2 in cultured AML cells (略)Table 4. Effect of VEGF121 on the expression of MMP-9 in cultured AML cells (略)
VEGF121VEGF121对AML细胞和HL-60具有抗凋亡作用
为了进一步探讨VEGF121对白血病细胞的作用，我们观察了HL-60细胞和3例原代AML细胞在有或无血清、有或无VEGF121的情况下的生长状态。培养48小时后，所有无血清孔（包括VEGF121阳性 和阴性）中的存活细胞数均开始迅速下降，到第7天的时候，细胞数已经所剩无几，提示VEGF121不能对抗血清剥夺所造成的细胞凋亡。在含有5％新生牛血清的培养孔中，经过7天的培养，HL-60细胞和1例AML原代细胞在有或无VEGF121的培养孔中，呈现出不同的生长状态（图2）。
VEGF121上调HL-60细胞株中bcl-2的表达
为了探讨出现上述情况的原因，我们又用HL-60细胞在培养瓶中重复了上述实验，并用RT-PCR的方法检测了VEGF121对 HL-60细胞中bcl-2的影响。结果显示：VEGF121促进了HL-60细胞中bcl-2的表达。
MMP-2、MMP-9及VEGF与髓外浸润的关系
髓外浸润组中MMP-2 mRNA表达率为91.7％，平均表达水平0.941；MMP-9 mRNA表达率为75％，平均表达水平0.931。无髓外浸润组中，MMP-2 mRNA表达率58.5％，平均表达水平0.439；MMP-9 mRNA表达率37.7％，平均表达水平0.202。两组对比，MMP-2，MMP-9表达率、表达水平均有显著性差异(P<0.05)（表5）。VEGF与髓外浸润的关系见表6。Table 5. Relation between VEGF mRNA and extra-medullary leukemic infiltration in AML patients（略）Table 6. Relation between VEGF mRNA and extramedullary infiltration in AML patients（略）
讨 论
本研究结果显示，AML患者中MMP-2，MMP-9与VEGF的mRNA和蛋白水平呈正相关，VEGF阳性组的MMP-2和MMP-9的mRNA水平高于阴性组，这与Hayashibara等［2］在成人T细胞白血病（ATL）中的研究结果相近；在缓解期患者和正常对照中没有相关性，但这不能否定VEGF与MMP-2，MMP-9的关系，因为MMP-2，MMP-9在体内有着广泛来源，如中性粒细胞、巨噬细胞，MMP-9还可以来源于较成熟的造血细胞，这也可以解释为何在缓解组和正常对照中MMP-9也有较高水平的表达。进一步分析实验结果发现，在AML组中MMP-9与VEGF的相关性（r＝0.449）比MMP-2（r＝0.387）好，提示MMP-2，MMP-9在AML中的表达有可能被VEGF上调。
VEGF和MMP-2，MMP-9都参与了血管新生，二者之间存在调控关系。VEGF一方面可以促进内皮细胞增殖，另一方面还可以促进内皮细胞表达MMP-2或MMP-9降解细胞外基质，而内皮细胞的增生和细胞外基质的降解被认为是血管新生的两个基本环节。国外有研究报道它们在恶性血液病中也存在调控关系，Janowska-Wieczorek等［4］发现，VEGF可以促进CML细胞表达MMP-9；Dias等［5］发现，在AML细胞中加入重组人VEGF165后，这些细胞中MMP-9的酶活性增高。
为验证这些观点，探索VEGF对MMP-2，MMP-9有无作用及其作用机制，我们进行了原代细胞和HL-60细胞的培养实验。结果发现加入VEGF121作用24小时后，HL-60细胞中MMP-2，MMP-9的表达均升高，加入VEGF121的原代细胞中MMP-2的平均活性较对照组增高（P＝0.045），而MMP-2、MMP-9的mRNA和MMP-9活性水平虽然也有所增加，但均无统计学差异。这与前面MMP-9与VEGF的相关性比MMP-2好的结果有所矛盾，但并不能否认VEGF对MMP-2，MMP-9的影响。分析其原因可能有：①病例数较少；②MMP-9的阳性率比MMP-2低，且MMP-9的活性在不同患者之间差异较大而造成了统计学偏差。
进一步分析结果发现，VEGF121仅能促进部分AML细胞表达MMP-2或MMP-9，而另一部分对其没有反应（图3），可能与下列因素有关：①，VEGF的作用是通过VEGF受体介导的，细胞对VEGF的反应首先取决于细胞是否表达VEGF受体；②，MMP的表达存在着异质性。这可能也是造成两组间没有统计学差异的一个原因。这与Dias等［5］的研究结果相符，他认为VEGF的两个主要受体VEGFR1和VEGFR2都参与了这一过程，但他未直接证明这一点。在内皮细胞中的研究结果显示，VEGFR2主要介导促增殖和抗凋亡作用，而VEGFR1可以介导细胞的运动，促进尿激酶、纤溶酶激活物的抑制物和MMP-9等的产生［6］。因此，VEGF对AML细胞中MMP-2，MMP-9的具体调控机制还有待于进一步研究。
我们对65例AML患者的临床资料进行分析发现，有髓外浸润的患者高表达MMP-2、MMP-9和VEGF，提示它们可能共同参与AML患者髓外浸润的发生。已有研究发现，AML细胞既可表达有功能的VEGF受体，也能产生VEGF。如果在一个白血病细胞中形成这样一个自分泌模式，进而促进MMP-2或MMP-9的表达，则很可能会在临床上形成高侵袭性表现。
除促进MMP-2，MMP-9的表达之外，本研究还提示VEGF在白血病中可能具有抗凋亡或促增殖作用，在含有5％新生牛血清的培养体系中加入50 ng/ml的VEGF121可以明显增加HL-60细胞和部分原代细胞的存活细胞数。我们经RT-PCR证实，VEGF121提高了bcl-2在HL-60中的表达，说明VEGF在急性白血病中发挥了抗凋亡作用。不过，本实验结果不能证明或否认VEGF在AML中的促增殖作用。在国外的一些研究中，Dias等［5］用单克隆抗体封闭的方法证明VEGF可以通过VEGFR2促进AML细胞的增殖，他的另一项研究则显示：VEGF可以通过热休克蛋白-90（HSP90）诱导白血病细胞产生bcl-2，进而发挥抗凋亡作用［7］。总之，VEGF在白血病中发挥这些作用的具体机制尚未明确。对此进行更深一步的研究有助于我们了解白血病细胞髓外浸润的机制，为和预防AML患者髓外浸润、进一步改善其预后提供理论基础。
【】
1Lamoreaux WJ，Fitzgerald ME，Reiner A，et al. Vascular endothelial growth factor increases release of gelatinase A and decrease release of tissue inhibitor of metalloproteinases by microvascular endothelial cells in vitro．Microvasc Res，1998；55: 29-42
2Hayashibara T，Yamada Y，Onimaru Y，et al. Matrix metalloproteinase-9 and vascular endothelial growth factor: a possible link in adult T-cell leukaemia cell invasion. Br J Haematol，2002；116: 94-102
3杨天楹.急性非淋巴细胞白血病的形态学分型.见:张之南，沈悌主编.血液病诊断及疗效标准. 第二版.北京：出版社，1999：171-173
4Janowska-Wieczorek A，Majka M，Maquez-Curtis L，et al. Bcr-abl positive cells secrete angiogenic factors including matrix metalloproteinases and stimulate angiogenesis in vivo in Matrigel implants. Leukemia，2002；16:1160-1166
5Dias S，Hattori K，Zhu Z，et al. Autocrine stimulation of VEGFR-2 activates human leukemic cell growth and migration. J Clin Invest，2000；106: 511-521
6Zachary I. Signaling mechanisms mediating vascular protective actions of vascular endothelial growth factor. Am J Physiol Cell Phy-siol，2001；280: 1375-1386
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