正交设计编程及科研应用实例
作者：成微 储成顶 王世亮 俞敏 鲍玉婷 马晓芹
【关键词】 正交
摘要：目的：在科研工作中推广应用正交设计方法。方法：以VBA语言自编正交设计软件模块，加载于ECXEL平台，并予以剖析及实例应用。结果：程序能准确选定考核指标，进行直观和方差分析，给出试验的优选方向和“可能好配合”。结论：该软件模块运用方便，可正确使用公认准测进行数据处理。
关键词：正交设计；因素；水平；直观分析；方差分析
在科研实验例如新药研究领域，探索配方，论证方法，均需对诸多影响因素及水平作出比较选择。这种选择试验的巨大投入，往往成为许多研究者的困惑。此时，合理的正交设计，就可能是解困的关键［1~4］。基于此，笔者一直探索在微软EXCEL平台编制和应用正交试验软件模板［5］，现报道如下。
当然，相对于权威统计软件SAS这一“摩天大厦”，笔者只是试建一个“小便利店”。对一般性任务用户而言，后者不止是方便，更因其有人人熟悉的“一元化”界面及无需前期学习的特点而在实际上促进了统计理论在药研工作中的理解和推广。
据笔者经验，药研试验中最多见的当是2~7个因素、2~3个水平的优选。因此在该软件的10版本中，我们仅设计4个正交表头模板 ：L8(27)、L9(34)、L16(215)、L8(4×24)(混合水平表)，分别在sheet1~4之间安排。同时为了满足部分用户的更高要求，在sheet5以后的表中，另设计含有交互作用处理的正交处理模板：L8(27)、L9(34)。
1 正交模板程序流程
模板流程为完全模仿试验者的实际需要步骤，以一个条件优选试验为例：首先是试验者提出计划设定因素及水平，接着由模板 确定试验项目详细安排试验实施表，然后试验者按图索骥进行条件水平试验，最后将试验结果再输至模板中，由程序进行各种分析，最终给出试验的优选参数或方向。因此，各模板都将具有以下6块结构并自动协调执行：
11 正交设计表头
向用户提共正交设计的规范表头。
12 设定因素及水平
显然，这是一个试验参数输入区，即设定的因素及水平值。输入后程序即自动在下面
13块中生成试验实施表。
13 试验实施表及试验数据
研究者可按试验实施表组织试验，并于试验后输入正交试验结果。点击处理图标后，程序即进行自动运算。由于本块为试验实施表，含有各因素列的有序排列，故相应增加若干行，用来显示对正交结果的直观分析，如此使模板界面更加整洁。
14 方差分析表
无须赘言，这是本模板的精髓所在。
15 中间参数
因正交试验结果的直观和方差分析均需要一些中间数据，就列放于本块之中。此外，在本块的适当醒目位置，另设有一些幽默的提示语言栏及小动画设置，告诉用户操作中的失误或指导进行某步的操作。当然，作为一个软件界面，还附加了一些诸如时间、次数、备份资料等一些有用的信息。
16 程序校验
此块是隐藏的，并不显示于模板界面上。根据笔者经验，任何程序都难免遭受病毒攻击，故从SAS分析实例中精选一批数据，当激活检验图标时，这些数据将以只读形式输至本模板，并予处理，处理结果(包括大量中间参数)与预存数据比较，从而判断模板是否出错并提供信息。
2 部分编程处理原则或原理
模板制作采用VB语言后台编程和前台EXCEL公式构建相结合的方式。部分编程原理是：
21 试验结果的判断指标的处理
正交试验的观察指标(即试验结果)往往不止一套，各自的判断(或考核)指标也不会一样，程序将视以下几种情况分别处理并在提示栏公布信息和指标方法：①以大为优时(例如考核试验结果的回收率)，试验者应在模板指定位置处(在该结果数据列的下方)填上“max”或“大”字符，程序读取后，即按正常模式进行处理。②以小为优时(如考核试验结果的精密度值RSD)，则应填为“min”或“小”，模板会将数据x作倒数变换成1/x后处理。③以某定值d为优时，则应填上这个定值d，模板会将数据x按公式1/(x-d)2变换。④以远离某定值d为优时，则应分别填上：>d(越大越优)，
模板的10版本上共设有4列试验结果列，允许用户输入并同时自动处理4套结果数据。若无4套结果，可以空置。程序读到空白列时即自动跳过此列，并在提示栏公布信息。
22 试验结果的直观分析
直观分析的原理在此不赘述，读者可参阅相应的统计书籍。直观分析图对EXCEL来说是易如反掌。但程序试用后，有用户反映图似多余，现10版本中予以删除。当然，直观分析图所展现的优选趋势，程序中已作相关的运算：除提示“可能好配合”外，凡是优选水平为中间值的，模板会提示“似在附近”；而优选水平为高低限的，则会提示“似为更高”或“似为更低”。此种处理，经部分药研工作者试用，反映较好。
23 试验结果的方差分析
方差分析的原理亦不赘述，读者亦可参阅书籍。方差分析是调用EXCEL自身集成的方差分析模块，并在本模板中巧妙组合。方差分析结果可提示因素的显著性和重要性，用以结合直观分析结果而共同确定最优水平。
24 试验结果的最终优选综合
程序确定的原则是：对于由方差分析提示的重要因素，其水平就取直观分析建议的优选水平，按其取优或建议补做进一步试验。对于方差分析提示为不显著或最不重要的因素，优选水平的确定由用户根据节约、高效、方便的原则自行确定。当然，程序仍给出“可能好配合”的建议。
25 试验结果的交互作用分析
交互作用的分析原理仍不赘述。在可分析交互作用的模板内，程序按通用规则进行处理，并兼顾直观和方差分析的结果，对所有的交互作用作显著性判断，最终对各交互作用的重要性排序并予提示性输出，并将交互作用考虑进最终的优选方向推荐中。
作为数据处理应用系统，该软件已加载于安徽医科大学实验管理系统中，本研究第一作者可免费提示该程序离线用户版。
3 药研应用实例甲氨蝶呤缓释体内植入剂的体外释放方法研究
31 体外释放试验及测定方法
体外释放试验方法为等距浸出法/换液杯法。按此方法试验，其释放模型经理论及试验证明，与杯法完全一致(已另文发表)［5］。体内吸收率与体外释放度的关联按药典2000年版规定的“点对点相关”方法试验和检验(已另文发表)［6］。此前测知：甲氨喋呤稀溶液约稳定5d(变异系数CV≤5%)，故确定释放介质每4d更换1次。取样时间点为：2h,8h,24h,48h,72h,96h(第1次换液)，144h，192h(第2次换液)，240h,288h(第3次换液)，384h。测定方法为2000年中国药典甲氨蝶呤项下方法。
32 正交试验及因素水平选择
影响体外释放的因素较多，一些是不容改变的，例如温度37±0.5℃。可选择改变的重要因素有4个：释放介质(种类)、介质浓度、介质体积及搅拌转速，设计为四因素三水平的正交优选试验。根据我们的实践，该四因素间交互作用较小(仅介质种类和浓度间可能有微弱的交互作用，而选择适当时亦可使浓度因素近似成为独立变量)，故以正交表L9(34)实施，以减少试验工作量。
321 介质种类及水平的选择
该制剂的辅料为可降解型聚L乳酸。针对其特点，介质种类重点考虑介质的酸碱性：选酸、中及碱性3种，即pH值分别为≤6、7及≥8的二元缓冲溶液。
322 浓度因素及水平的选择
对应地，浓度因素的类型定为等渗比例(稀释)浓度，而不选摩尔浓度和一般的质量|体积浓度。因后两者的同一水平对不同的介质有相对复杂的不同效应，但等渗比例浓度不然，同一水平有相同的渗透压(当然，稀释后为非等渗液)，并不论介质如何变化。特别地，渗透压又可能是影响药物体内释放与吸收的重要因素。
323 浓度水平的选择
并不选0水平即纯水。因该水平将导致因素(介质种类)差异消失，不符合正交设计的初衷。实际设计为100%(等渗液)、25%(等渗液+水=1+3)、10%(等渗液+水=1+9)的比例等渗浓度。为了不漏掉对水介质影响释放的观察，在上述正交试验后，以优选的其他因素水平，另做以纯水为介质的试验。
324 介质的体积及水平选择
以确保体外释放漏槽效应为前提而确定之：每试验杯/瓶投药1包装量(甲氨蝶呤5mg)，介质体积水平分别取100、200、500mL。
325 搅拌转速及水平选择
参照2000年药典释放度项下规定，选转速水平为0、50、100r/min。
33 正交试验结果(考核指标)的优选认定
缓释制剂的体外释放是比较复杂的试验，其结果的优选判断亦很不易。我们选择的是综合考虑以下3套：
331 各试验结果的拟合模型及拟合优度
模型为一级或Higuichi方程，拟合优度以相关指数与残差平方和之商(记作R2/Mse)衡量之，以大为优。
332 各试验结果的精密度
各试验做3份平行样，求得各时间点的精密度(相对标准偏差RSD)和所有时间点的平均RSD，以小为优。为便于文中展示，求其倒数后输入(记作1/RSD)，仍以大为优。
333 各试验达75%释放度的时间
以靠近10d为优(注：若考虑减小试验工作量，当采用适当的体外释放介质，使体外释放周期明显小于其标称体内缓释期。但据此前大量试验，若两者不同，体内外相关较难。故择相近的释放周期：以约10d达到75%释放度为优选目标)。该数据可按拟合模型求算，即取所得释放曲线上对应于75%释放度的天数d。按定值d为优方式，将此天数减10后平方再取倒数值(记作1/(d-10)2)，以大为优。
34 试验结果
341 正交试验数据
正交表头的设计见表1，正交试验的结果见表2。表1 正交表头L9(略)表2 正交试验结果（略）表3 方差分析结果（略）
① 关于释放介质
从试验结果看，3类结果均显示释放介质是显著性因素，可能好水平为pH>8。这符合该试药的特点。因辅料是聚L乳酸，它的高分子链端基因当然与稀碱溶液相容更好，故在碱性介质中的释放也相对最理想。试验中观察到：中或酸性的介质均导致释放偏慢，释放后期所取的样液浓度小，误差大，这亦是RSD变差，拟合优度下降的合理解释。
② 关于介质浓度
它的重要性仅在试验结果1/(d-10)2的分析中被提示，在另两类结果中均为最不重要因素。故就取被提示的可能好水平。试验中观察到：对被优选的碱性介质而言，浓度与释放速度成增函数关系，当介质浓度是100%时达75%释放度的时间是6d左右，而10%时达75%释放度的时间是13d左右，以25%(约10d)最符合我们的期望。
③ 关于介质体积
3类结果均提示介质体积在200以下，其中试验结果R2/Mse提示为影响较显著，可能好配合为200。考虑到此体积并不算太大，试验中所取样液的浓度也较合适，就取此值为释放介质的体积。
④ 关于搅拌转速
无须赘言，就取试验结果1/RSD的分析所提示的可能好水平50r/min，这也恰是3个水平中的中值。
1 周同惠，汪尔康，陆婉珍分析化学手册・第一分册北京：化学出版社，1999，623~63`;694~706.
2 Kathy Ivens, Conrad Carlberg. Excel 2002:The complete Reference(M). Beijing:China Machine Press,2001,369~451
3 Charles. Stone. A Course in Probability and Statistics. Beijing: China Machine Press, 2003,628~672.
4 陈魁应用概率统计北京：清华大学出版社，2003,262~301.
5 王世亮，储成顶，刘飞，等一种新的长效制剂体外释放方法―“等距浸出法”中国新药杂志，2003，12(8)：627~630.
6 储成顶，王世亮，周浩炳，等缓释制剂的体内外相关性试验及检验中国新药杂志，2003，7(7)：540~543.
