造血细胞生长因子在脐血体外扩增中作用研究的进展
【关键词】 造血
摘 要：人脐血中造血干/祖细胞增殖能力强，但单份脐血数量有限，因此目前脐血移植多用于低体重儿童。造血细胞生长因子具有促进脐血扩增的作用，在不同的造血细胞生长因子联合作用下，可以有目的地进行体外扩增，从而使单份脐血有望解决高体重儿童及成人脐血移植存在的造血干/祖细胞数量不足的问题，为脐血广泛应用于临床移植作出贡献。
关键词： 造血细胞生长因子； 脐血； 造血干/祖细胞； 体外扩增 脐血干细胞移植的生物学基础研究和临床移植近年来取得很大进展。自从1988年法国的Gluckman等首先成功移植治疗Fanconi贫血后，世界各地相继开展这方面工作，目前已成功用于治疗血液系统恶性疾病、恶性实体瘤、遗传性疾病等多种疾病，但因单份脐血可采量有限。Regidor［1］等报道单份脐血含有核细胞（nucleated cells, NC）和CD34+细胞分别为1.2×109和3.1×106。Gluckman［2］等认为，脐血移植所需NC及CD34+细胞理想值应分别达到3.7×107/kg和3×105/kg受者体重，故目前多用于儿童。因此体外扩增脐血定向祖细胞同时维持干细胞的数量和活性，加快短期造血重建，是脐血移植应用于较大儿童和成人所面临的关键问题，而造血细胞生长因子则是脐血体外扩增必不可少的因素。因此，近十余年来，探讨不同因子在脐血体外扩增中的作用，寻求其合理有效的组合及扩增时机等的研究备受关注，其研究成果也必将为脐血广泛应用于临床做出贡献。
1 脐血的生物学特性
11 造血干/祖细胞及表型标记与检测指标
通过对人和鼠类造血干/祖细胞的研究证明，造血干细胞没有特殊的形态学特征，它比中等大小圆形淋巴样单核细胞略小，比重较轻。99.5%以上处于Go期，祖细胞比重稍大，它们在流式细胞仪上表现在低前角光散射和低到中度垂直光散射。在人类尚无检测真正造血干细胞的方法，一般认为体外长期培养的起始细胞（LTCIC）或爆式集落形成单位（CFUBI）可代表干细胞的数量，而粒/红/巨噬/巨核细胞集落形成单位（CFUGEMM）则代表多能造血祖细胞。目前人类造血干细胞的较完整的标记应该为：CD34+，AC133+，CD117+，CD135+ ，CD38- ，CD33- ，CD90low ，CD71-，HLA-DR- ，mCD45RAlow ，Lin- ，RH123low，HD33342low 。而最近的研究已有充分证据证明在CD34+细胞之前存在着CD34-的造血干细胞。
12 脐血干/祖细胞生物学特性
在胚胞发育过程中，造血干细胞是从卵黄囊全能间叶细胞分化而来的，胚胞发育至3~5月时，造血主要发生在肝脏和脾脏中，因此其中含有大量的造血干细胞和祖细胞，虽然其中造血祖细胞的含量随胎龄的增大而减少，但足月新生儿脐血中的含量较正常骨髓高，且更幼稚些，脐血中CD34+细胞含量约1%~2%，研究还证实脐血中的造血干/祖细胞的增殖分化能力，体外集落形成能力，刺激后进入细胞周期的速度，自泌生长因子的能力较骨髓和外周血中强［3］；他们的端粒及端粒酶也长于和高于骨髓和外周血的干/祖细胞，且低表达或不表达细胞凋亡配基CD95/Fas，移植后寿命更长；脐血造血干/祖细胞对多种造血生长因子刺激的反应远强于骨髓及外周血的。因此，体外短期扩增便可获得大量造血细胞供成人移植。另一方面，脐血淋巴细胞和成人外周血淋巴细胞间存在许多量与质的差异。前者淋巴细胞数高于后者2~3倍，CD8+者比例低，其T细胞有未成熟的特性，缺乏T细胞活化/生长因子，抗原表达弱而不充分，杀伤（NK）细胞活性较多，对有丝分裂原PHA、CONA有较好的反应，但对异基因抗原的反应性差，这些免疫学特性有利于移植成功及成功后GVHD的发生率和程度均较骨髓和外周血干细胞移植者低。
2 造血细胞生长因子（HGFS）在脐血体外扩增中的作用
21 造血细胞生长因子（HGFS）的分类
HGFS是对造血干/祖细胞的增殖和分化直接或通过辅助细胞释放，其他细胞因子间接起调节作用的因子，根据其生物学活性，可分为4类：①作用于干细胞和早期祖细胞的生长因子：如干细胞刺激因子（SCF/CKit配体），Fit3配体（FL），基质成纤维细胞因子（bFGF）、白细胞介素6（IL6），IL11及白血病细胞抑制因子（LIF）。其中IL6是对造血及免疫有多种功能作用的细胞因子。②多系祖细胞刺激因子，如IL3及GMCSF等，它们主要刺激祖细胞的增殖与分化。③作用于晚期（单向）祖细胞的造血生长因子，如红细胞生成素（EPO），粒细胞刺激因子（GCSF），单核细胞系刺激因子（MCSF/Cfms 配体），IL5及血小板生成素（TPO）等，它们主要作用于单向造血祖细胞，供进一步分化为各类前驱细胞和成熟细胞。然而其中一些也对早期或多向祖细胞有一定作用，如TPO对造血干/祖细胞也有直接刺激作用。④造血细胞增殖负调控因子，如选择性抑制造血祖细胞的βT细胞生长因子（TGFβ），还有巨噬细胞炎性蛋白1α（MIP1α）、干扰素γ（IFNγ）、干扰素α（IFNα）、血小板第四因子（PF4）及肿瘤坏死因子α（TNFα）等。
22 造血生长因子的联合应用
实验表明，造血生长因子是脐血体外扩增的必要条件，而多因子联合应用的扩增体系较单一细胞因子的扩增体系效果大大增强，因此寻求合理有意义的细胞因子组合扩增体系是关注的焦点。实验研究表明，在一些细胞因子作用下，脐血的CD34+细胞经1~2周培养即可使细胞总数扩增30~1000倍，集落形成细胞扩增41~190倍，但是这些细胞因子的组合在扩增细胞的同时也明显加速了干/祖细胞的分化，目前研究的重点是如何在扩增造血细胞的同时，又尽可能的保留造血干细胞并扩增早期造血祖细胞。
221 正调控因子的联合使用：①在扩增体系的细胞因子组合中，必须包括有FL或SCF，FL与SCF同属酪氨酸激酶受体TKR家族，通过其特异性TKR结合向细胞内传递信号，启动早期祖细胞的分裂和增殖，促进其生长，抑制凋亡，但两者在人与鼠的HSCs表达有差异。Sitnicka E［4］等人的研究中发现，FL比SCF对人的HSCs作用更强，而SCF比FL对鼠的HSCs作用强，实验表明，脐血CD34+细胞在SCF+IL3+IL6+GMCSF+GCSF刺激下，有核细胞，CD34+细胞，CFUGM和LTCIC分别扩增了2500，39，49和2.5倍［5］。Kogler［6］等对不同的因子组合进行比较，发现脐血CD34+细胞在SCF+FL+IL3组合中获得CFUGFMM的最大扩增（94倍），如再加入GMCSF，EPO等系特异性因子，只能增加CFC和NC总数，而CFUGEMM无明显增加，新近研究表明，FL、SCF、TPO是扩增早期干/祖细胞必不可少的。NgYY［7］等认为，FL、TPO、SCF是体外扩增早期干/祖细胞的最强因子，在他们的实验研究中，三者联用CD34+CD38-细胞扩增了80~120倍，且在体内能继续分化为各类细胞。国内唐瑟［8］等研究亦表明三者联用较单一应用效果显著，且能维持再造血能力。②脐血造血细胞扩增研究中，血小板生成素（TPO）的作用越来越受到重视，TPO与SCF、IL3或FL联合可加速静止期的细胞进入细胞周期，也可维持原始造血细胞存活并抑制其凋亡，有人联用FL和TPO能维持脐血CD34+细胞持续生长和扩增超过6个月，CFUGM可增加200万倍，而LTCIC扩增了20万倍，说明该因子组合既保持自我更新能力又极大地扩增了造血细胞［9］。③IL3的作用仍存在争议，Bruno S［10］等应用TPO+FL+SCF加IL3或IL6对脐血进行体外扩增，研究中发现，扩增8周时CD34+细胞数量明显增加，但LTCIC在6周时即开始下降并消失，扩增细胞再植入NOD/SCID鼠6周时基本观测不到，提示IL3未促进UCBHSC的扩增，并影响扩增细胞再植入能力。而Robmanith［11］用FL、SCF、TPO和IL3不同组合对脐血CD34+细胞进行无血清体外细胞培养法培养7天，在有或无IL3的情况下CD34+脐血细胞分别增加（20.9±5.4）倍和（9.3±3.2）倍，LTCIC分别增加了（16.3±5.5）倍及（12.6±5.6）倍，定向克隆形成细胞分别增加（18.1±2.4）倍和（9.1±2.0）倍，再用扩增细胞及未扩增细胞植入亚致死量照射的NSD/SCID鼠6周后发现：IL3促进了UCBHSC的扩增，且并不损害扩增细胞的再植入能力。④脐血造血细胞可通过选择适当的因子组合以实现某类细胞的定向扩增，巨核系定向扩增的临床意义尤为重要，亦为研究的热点。Tao等［12］单用TPO对脐血CD34+细胞进行扩增，发现14天时，CD41+CD14细胞含量扩增了27250倍，但大部分CD41+细胞为不成熟的二倍体。国内学者莫文健［13］等联用IL3、IL6、SCF与TPO对脐血CD34+细胞进行扩增，10天时CFUMK有最大程度的扩增（6.8倍），而且CD41+细胞产量亦最高，且巨核细胞成熟良好。Shaw PH等［14］用IL3、TPO、SCF、FL、加GMSCF或EPO或二者均不加对脐血进行扩增，16天后，三组均得到了有效扩增，但加GMCSF与EPO组与不加者无明显差别，提示IL3、TPO、SCF、FL4种因子组合即可有效扩增巨核子，而GMCSF、EPO对扩增无益。Proulx C［15］等用TPO、FL、SCF对巨核因子进行扩增，再向扩增后的细胞体系中加SCF、FL、TPO、IL6进行第二次扩增，结果显示细胞数增加了300倍，且获得了大量的成熟的多倍体。
222 造血负调控因子的应用
目前基础与临床研究的重点多用正调控因子组合来进行脐血的扩增，而造血负调控因子是维持正常造血不可或缺的细胞因子，近年来受到更多研究者的关注：①TGFβ目前认为是作用最强的一种负调控因子，研究表明，通过消除抑制因子作用可提高扩增效果。Gardon用抗TGFβ1的抗血清或反义TGFβ1寡核苷酸来阻断脐血细胞自身分泌TGFβ1的抑制作用，从而促进脐血CD34+ CD38细胞增殖，国内学者也对此作了研究。吴英理［16］等应用MIP1β及TGFβ抗体作为造血负调控因子的拮抗剂，改善了基质体系的扩增效果，而且两者联合应用，扩增效果明显。但新近郝思国［17］等研究表明，高浓度的TGFβ1对造血细胞的增殖有明显的抑制的作用，而低浓度的TGFβ1对各种细胞的扩增抑制并不明显，提示扩增中应用适当浓度的TGFβ1不仅不影响造血细胞的扩增，而且能明显延缓和减少造血祖细胞在扩增的分化，明显地提高扩增细胞中造血祖细胞的含量。②TNFα作为另一种负调控因子，Xiao w［18］ 等的研究结果表明， TNFα对造血细胞有直接抑制作用。另有研究表明TNFα对造血细胞的扩增与其浓度有密切关系，低浓度时有刺激造血细胞增殖的作用。国内钱文斌［19］等应用TNFα与细胞因子联合，CD34+细胞细胞总数和CFC数分别是对照组的（17±3）倍和（8±2）倍，在无TNFα体系中，扩增高峰在第3~4周，而含有TNFα的培养体系第2周造血细胞显著增殖，表明TNFα能加快CD34+细胞的增殖和分化。
目前对造血负调控因子在脐血体外扩增中的应用已受到关注，但因造血调控的复杂性，其研究还有待进一步深入，但将正负调控因子联合应用，寻求合理组合，选用合适剂量必将为脐血体外扩增研究带来更光明的前景。
23 扩增时间
从临床应用来看，以短期培养为宜，邱莲女［20］等用GCSF、GMCSF、IL3、IL6，SCF及EPO联合组合长期培养MNC并进行动态观察发现，造血干/祖细胞在培养7天最多，14天开始下降，提示脐血体外扩增时间以7~14天为宜。
3 展望
随着脐血造血干细胞基础研究的深入，特别是体外培养技术的飞速，在造血细胞因子作用下单份脐血经体外扩增后用于高体重儿童及成人移植已成为现实，但还有许多问题有待于进一步探讨，如什么样的细胞因子组合可作为最佳的扩增体系？造血负调控因子如何更好地与正调控因子联合对脐血进行体外扩增，扩增后细胞的生物学免疫学特性是否有改变等等，这些都将是今后工作研究中需进一步探讨的问题。
参 考 文 献
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