Fas诱导细胞凋亡与糖尿病心肌病变的研究

【摘要】  目的： 探讨Fas诱导细胞凋亡对糖尿病心肌病变的影响，为进一步研究糖尿病发病机制提供实验依据。方法： 按体重将动物随机分为正常对照组(10只)和实验组(20只) ,各组大鼠禁食12h 后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射STZ溶液(用0.1mol/ L、pH = 4.4 的构橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg/ml的STZ 溶液),正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液。观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。1周后,采尾血测血糖,以血糖浓度>16.6mmol/L ,饮水量>40ml/d ,尿糖强阳性( + + + ～ + + + + )的大鼠作为糖尿病大鼠。6周后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学实验观察。利用HPIAS?2000图像分析系统测定Fas在以上两组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果： 糖尿病对照组心肌细胞胞浆内可见极少量棕黄色颗粒，Fas表达弱；实验组心肌细胞胞浆内可见较多棕黄色颗粒，Fas呈强阳性表达。图像分析结果显示对照组与实验组之间Fas的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.05)。结论：糖尿病心肌病变过程中存在心肌细胞凋亡,心肌细胞凋亡可能是导致糖尿病心脏功能障碍的重要原因之一。

【关键词】  糖尿病; 心肌; Fas; 大鼠

　　糖尿病是威胁人类健康的重大疾病之一，并呈持续增长，对人们的身体健康造成极大威胁。我国2型糖尿病发病率的上升速度远远快于世界水平，预计2010年我国2型糖尿病发病率将达到12%。大量临床资料和流行病调查均显示心血管疾病是糖尿病患者死亡的主要原因。糖尿病心肌病的概念于1974年Hamby［1］等首次提出，经过多年研究之后，学者们证实，糖尿病心肌病系由代谢紊乱触发，引起心肌学改变，从而出现亚临床的心功能异常，而后进展为心肌小血管病变、微循环障碍及心脏自主神经病变，导致心功能不全［2］ ，是一种独立的疾病。细胞调亡是细胞主动发生的死亡过程,是生物体借以拮抗有丝分裂所致的细胞增殖、调节细胞群体数目相对恒定的重要方式。调亡就象秋天枯萎的树叶一样慢慢地、悄无声息地从树干上飘零下来。细胞凋亡不仅是认识细胞死亡过程的基础,而且对胚胎发育、造血、免疫乃至肿瘤的研究都有极为重要的意义。细胞凋亡是细胞内死亡程序活化而导致的细胞自杀过程。凋亡大多发生在生理情况下,某些病理性刺激也可诱导细胞凋亡。Fas又称作APO?1，属于肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor, TNFR）和神经生长因子受体（nerve growth factor receptor, NGFR）家族成员。它是广泛分布于多种细胞表面的一种跨膜糖蛋，如活化的 L、J 淋巴细胞、单核细胞、维细胞、内皮细胞、肝胆细胞、肾小球系细胞及子宫内膜细胞等。研究表明Fas还可以通过神经鞘磷脂（sphingomyeline, SM）途径介导细胞凋亡信号的传导，即Fas被激活后，胞内鞘磷脂酶活化，水解SM产生神经酰胺（ceramide, CM），CM作为第二信使，传递凋亡信号［3］。目前关于糖尿病心肌病变过程中心肌细胞凋亡作用的研究报道甚少。本实验以链脲佐菌素( STZ)建立糖尿病大鼠模型,观察糖尿病大鼠心肌细胞凋亡,从而揭示心肌细胞凋亡在糖尿病心肌病变发生中的作用。

　　1  材料与方法

　　1?1  材料

　　1?1?1  实验动物  昆明种SD大鼠30只,雄性,体重180～200g ,武汉大学医学院实验动物中心提供,适应饲养1周后进行实验。

　　1?2  方法

　　1?2?1  动物模型建立及分组  按体重随机分为正常对照组(10只)和实验组(20只) ,各组大鼠禁食12h 后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射STZ溶液(用0.1mol/ L、pH = 4.4 的构橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg/ml的STZ 溶液),正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液。观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。注射后第2、7 d采尾血测血糖,以后每2周测一次血糖、尿糖,将血糖浓度>16. 7 mmol/L, 饮水量> 40 ml/ d , 尿糖强阳性( + + + ～ + + + + )的大鼠定为糖尿病模型。6周后将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学实验观察。

　　1?2?2  主要试剂  浓缩型鼠抗人Fas单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；超敏即用型S?P通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新生物有限公司）；显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。

　　1?2?3  主要仪器  YWY781型医用微波仪(浙江临安器材厂生产)；家用高压锅。

　　1?2?4  免疫组织化学S?P法检测Fas相关抗原  主要步骤：① 组织切片5 μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；② 3%过氧化氢37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；③ Fas采用微波抗原修复（3档，10 min）， PBS洗4×5min；④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应；⑤ 一抗（Fas，1: 100)37℃孵育1h，PBS洗4×5min；⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；⑦ 链霉菌抗生物素蛋白?过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1?3  免疫组织化学结果判断 Fas以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反应物。采用HPIAS?2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对Fas的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，阳性面积率（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100％）。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。

　　1?4  统计学处理对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK?q检验，检验水准α为0.05。

　　2  结果

　　对照组心肌细胞胞浆内极少棕黄色颗粒，Fas表达弱；糖尿病组心肌细胞胞浆内可见较多棕黄色颗粒，Fas呈强阳性表达。图像分析结果显示：对照组和糖尿病组平均光密度分别为0.0725±0.0049、0.2653±0.0875，对照组和糖尿病组阳性面积率分别为0.0816±0.0089、0.2234±0.0167。对照组与糖尿病组之间Fas平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.05)，见表1。

　　表1  对照组、糖尿病组Fas表达的平均光密度和阳性面积率（略）

　　注：* 对照组与糖尿病组比较，P＜0.05。

　　3  讨论

　　糖尿病是一种常见的具有遗传倾向的葡萄糖代谢和内分泌障碍,是由于绝对性或相对性胰岛素分泌不足引起的。近半个世纪以来,糖尿病患病率和死亡率有明显上升趋势,在我国已成为继心血管疾病、肿瘤之后列第3位的常见病、多发病和慢性非传染性疾病。糖尿病在病理组织形态上主要是由于胰岛损伤,胰岛素绝对或相对缺乏所引起［4］ 。近年来,国内外许多学者经过临床和流行病学调查,以及周密设计的基础研究和实验研究,虽然对糖尿病的病因有了较多的认识,但对原发性糖尿病的病因仍然不清楚。比较一致的看法认为与遗传、环境、病毒感染、肥胖、种族、营养物质代谢和内分泌失调等因素有关。引起生物体自由基生成增多的原因与诱发糖尿病的因素存在着交叉性，当自由基在体内的产生增加时,由于其特殊的细胞毒性作用,可对机体产生一系列的损害作用,其中对胰岛β细胞的损伤是引发糖尿病的一个重要因素［5~7］。关于糖尿病的发病原因,1型糖尿病已研究得较为深入,可能与HLA系统、基因突变等有关。关于2 型糖目前的认识是由遗传因素与环境因素共同作用,经由胰岛素抵抗、β细胞功能减退、临床糖尿病等不同阶段［8］。糖尿病的发病较为复杂,了解还远远不够。糖尿病患者在无明显微血管病变时也可出现心力衰竭,表明糖尿病患者心肌细胞本身可以发生结构和功能改变,提示有心肌病的可能［9］ 。Fas又称作APO?1，属于肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor, TNFR）和神经生长因子受体（nerve growth factor receptor, NGFR）家族成员。1993年人白细胞分型国际会议统一命名为CD95。人类fas基因定位于第10号染色体长臂，其编码产物为分子量45KD的跨膜糖蛋白Fas，其结构上分为胞外区，跨膜区及胞浆区［10］。Fas胞浆区C?末端有一段由80个氨基酸组成的死亡功能域（death domain, DD），Fas胞浆的死亡功能域DD对于将胞外死亡信号传递到胞内，启动死亡机器，导致细胞凋亡是必需的［11］。当Fas与Fas配体（Fas ligand, FasL）或抗Fas抗体结合后，可诱导自身三聚化，通过其胞浆区DD与胞质内的另一种蛋白质，Fas关联蛋白（Fas?associated death domain, FADD）的DD结合。FADD发生构象变化，暴露出其N?末端的死亡效应子功能域（death effector domain, DED），随之引发后续的Caspase?8的活化以及启动下游Caspase活化，介导细胞凋亡［12］。另外，研究表明Fas还可以通过神经鞘磷脂（sphingomyeline, SM）途径介导细胞凋亡信号的传导，即Fas被激活后，胞内鞘磷脂酶活化，水解SM产生神经酰胺（ceramide, CM），CM作为第二信使，传递凋亡信号［13］。已有的研究表明，Caspases?3是Fas介导细胞凋亡蛋白酶级联反应中的“核心”蛋白酶，抑制Caspases?3酶活性或拮抗Caspases?3功能可使Fas介导的细胞凋亡受抑，说明Caspases?3对Fas介导的细胞凋亡是必需的［14］。在过去的研究中我们已报道过Caspase?3在对照组心肌细胞胞浆内表达弱，糖尿病组心肌细胞胞浆内Caspase?3呈强阳性表达。本课题研究结果显示：Fas在糖尿病组的表达高于对照组，差异有显著性（P＜0.01)，这说明Fas是通过Caspase级联这一途径激活Caspase?3而诱发心肌细胞凋亡的。Cai 等［15］报道在糖尿病患者和动物模型中都可观察到心肌细胞死亡,通过抗氧化剂或凋亡信号途径的特异性抑制剂抑制心肌细胞死亡,可以明显的阻止糖尿病的心脏毒性,因此心肌细胞死亡在糖尿病性心肌病变中有重要作用。高血糖可直接导致活体心肌细胞凋亡,高血糖导致的心肌细胞凋亡至少部分是通过细胞色素C 激活的caspase?3 途径的激活而控制。目前,细胞凋亡研究日益受到重视。从某种程度上说,细胞凋亡与细胞的生长和分化同样重要,是细胞生命的基本特征之一。细胞凋亡是一个非常复杂的生理和病理过程,机体内、外多种因素可影响细胞凋亡的发生。细胞类型不同,受影响的因素也不同，有多种基因参与细胞凋亡过程的调控。今后需进一步研究和探索的是防止心肌细胞凋亡的发生和发展,减少细胞的丢失,从而阻止或延缓糖尿病心力衰竭的发生发展,改善糖尿病患者的预后。

【】
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　　3 Grullich C, Sullards MC, Fuks Z, et al. CD95 (Fas/APO?1) signals ceramide generation independent of the effector stage of apoptosis. J Biol Chem, 2000, 275(12): 8650~8656?

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　　13 Grullich C, Sullards MC, Fuks Z, et al. CD95 (Fas/APO?1) signals ceramidegeneration independent of the effector stage of apoptosis. J Biol Chem， 2000, 275(12): 8650~8656?

　　14 Wolf BB, Schuler M, Echeverri F, et al. Caspase?3 is the primary activator of apoptotic DNA fragmentation via DNA fragmentation factor?45/inhibitor of caspase?activated DNase inactivation. J Biol Chem, 1999, 274(43): 30651~30656?

　　15 Cai MP. The insulin resistance syndrome. In :Alberti KGMM,et al. eds. International textbook of diabetes mellitus ,V01. 2.Chichester :John B.Wiley &Sons ,1997，255～283?