RNA干扰与鼻咽癌的研究进展

【摘要】  RNA干扰（RNAi）是利用双链小片段RNA高效、特异性地降解细胞内同源mRNA，阻断体内基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型［1］。近几年，RNA干扰研究在国内外迅速开展，并且扩大到许多方面，如抑制病毒的研究、抑制多药耐药基因的表达 、在人体寄生虫研究中的应用、基因、肿瘤研究等。而鼻咽癌的发病机制与许多致病因素有关，实验研究表明RNAi可以通过多种途径影响鼻咽癌细胞的生长，因此RNAi可能为鼻咽癌治疗提供新的方法。

【关键词】  RNA干扰 鼻咽肿瘤 小干扰RNA

   1  RNAi的基本过程和作用机制

    RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA (double stranded RNA，dsRNA)介导、特异性地降解相应序列的mRNA，从而导致转录后水平的基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)现象，具有高效性和高度特异性，已成为基因功能研究中的一种快速、简便的新方法。目前主要有3种作用机制形式，即转录水平、翻译水平和转录后水平。其中转录后水平是RNAi在各种生物中实现的主要方式。

    1.1  转录水平  其干扰机制是通过改变靶基因染色质结构，使其基因转录受限，关闭表达系统。dsRNA被降解成21?23个核苷酸长的小片段RNA时，这些小的RNA分子在细胞核内可以诱导组蛋白H3的基因及相应DNA的甲基化［2］。这种序列特异性甲基化的信号与RNA和DNA结合有关。当dsRNA含有与启动子同源的序列，即可使同源靶启动子序列甲基化，从而使靶启动子失去功能，导致下游基因沉默，则转录不能进行。若甲基化出现在编码区，转录能进行，但在转录后水平上沉默。

    1.2  翻译水平［3］  主要干扰机制是通过抑制相应mRNA的翻译，使相应的蛋白质表达受阻。其中起重要作用的是微RNA (micro?RNA，miRNA)，它是由长度约70?nt的RNA形成的茎环样前体，经Dicer酶作用后形成长约21 25?nt的单链RNA，与相关蛋白结合成诱导沉默复合物［4］(RNA?induced silencing complex，RISC)，然后识别并结合在mRNA的3′末端非翻译区上，阻止核糖体与mRNA的结合及核糖体的移行，从而抑制翻译的进行。

    1.3  转录后水平  目前，转录后水平上的干扰是研究最多、最清楚的一种机制。其作用大致可分为以下两个阶段。

    1.3.1  siRNA形成阶段  外/内源性dsRNA通过Argonaute家族基因编码的蛋白质的识别，诱导dsRNA与Dicer结合。在ATP的参与下被Dicer酶切成21 23?nt长度的小干扰RNA (small interfering RNA， siRNA)。Billy等［5］在小鼠畸胎瘤细胞F19和P19的细胞质提取物中发现长727?bp的dsRNA被剪切为约21 23?nt片段，即siRNA，强烈抑制了同源基因的表达。Zamore等［6］报道，无活性RISC存在于胚胎细胞中，并以250?ku分子质量的前体形式存在，在ATP激活下加工成100?ku的RISC，切割底物mRNA。RISC与互补的靶mRNA结合，在酶的催化下切割、降解，从而达到干扰基因表达的作用。

    1.3.2  扩增循环阶段  RNAi的扩增循环机制即特异性siRNA与靶mRNA结合后，没有被活性酶切割、降解。而是以siRNA中的一条链为引物，以靶mRNA 的研究进展为模板，在RNA依赖的RNA聚合酶的作用下，延伸形成新的双链RNA，被Dicer内切酶或相关酶切割为新的21 23?nt siRNA。

    2  RNAi的特征

    2.1  高效性［7］  注入细胞内的siRNA比细胞内的mRNA量要少得多。但由于其自身的放大机制，仍可对目的基因产生有效地阻断。

    2.2  高特异性  由dsRNA降解成的小干扰RNA，除其正义链3′端的两个碱基在序列识别中不起主要作用外，其余碱基在序列识别中都是必需的，单个碱基的改变即能使RNAi失效，RNAi能特异性降解mRNA，针对同源基因共有序列的RNAi则可使同源基因全部失活。

    2.3  共抑制性  RNAi是双链RNA介导的转录后基因沉默机制，它的启动子相当活跃，外源基因可以转录，但不能正常积累mRNA。RNAi作用不仅使外源基因在转录后水平上失活，同时诱导与其同源的内源基因沉默。

    2.4  高穿透性  RNAi具有很强的穿透能力，能在不同的细胞间长距离传递和维持。

    2.5  遗传性  已在线虫中观察到RNAi效应通过生殖系统传递到后代，说明RNAi具有一定的遗传性。

    2.6  干扰结果出现快  RNA干扰基因的表达发生在转录后，通过降解细胞质中同源mRNA，阻断该基因的表达，干扰结果在短时间内就可产生，这是其他实验技术无法比拟的。

    2.7  双干扰系统  哺乳动物中存在有非特异性干扰和特异性干扰两条独立的途径。非特异性干扰反应是由大于碱基对(bp)的双链RNA介导，导致整个细胞中非特异性蛋白合成抑制，RNA降解；特异性反应由21 25?bp的小干扰RNA介导，可逃避非特异性干扰系统的监控，只降解与其序列相应的单个基因的mRNA。

    2.8  RNAi具有ATP依赖性  Dicer对dsRNA的切割、RISC的形成以及RdRP对沉默信号的扩增都需要ATP供能。

    3  RNA干扰治疗鼻咽癌前景

    3.1  EB病毒与RNA干扰  EB病毒又称人类疱疹病毒4型，是双链DNA病毒，人类是其唯一的天然宿主。已经被证实EB病毒与多种肿瘤相关，如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、何杰金病、胃癌等，其中EB病毒与鼻咽癌的关系尤为密切。几乎世界各地所有鼻咽癌患者的癌组织中，均可检出EB病毒的DNA和EB病毒核抗原［8］(EBV nuclear antigen，EBNA)。研究发现，96％的鼻咽癌患者血浆中能够检测到EBV DNA的表达和EB病毒核抗原，鼻咽癌患者血清中含有较高滴度的EB病毒特异的VCA IgA或EA IgA［9］。EB病毒特异性抗原包括病毒潜伏感染时表达的抗原LMP、EBNA和病毒增殖性感染相关的抗原(MA、EA、VCA)。其中潜伏膜蛋白1(1atent membrane protein 1，LMP1)是目前已经被证实在EBV所引发细胞癌变和癌转移过程中的致癌物质。LMP1生物学功能主要包括下调E?钙黏蛋白表达，诱导matrix metalloproteinases家族基因表达［10］，激活UK尿激素纤溶酶，增加细胞跨膜移行能力，从而降低肿瘤细胞粘附力，降解细胞外基质和基底膜，刺激新血管增生，有助于鼻咽癌发生、生长和转移。Li等［11］用RNAi抑制EB病毒LMP1蛋白的编码基因发现，LMP1 mRNA水平下降90％以上，且E?钙黏蛋白mRNA表达增高，使鼻咽癌细胞被阻滞在细胞周期的G0 G1期，达到抑制肿瘤细胞增殖的效果。提示RNAi能抑制LMP1蛋白的表达，为鼻咽癌的治疗和预防提供新思路。

    3.2  鼻咽癌的原癌基因与RNA干扰  鼻咽癌的原癌基因编码的蛋白主要包括基因转录调节因子、生长因子及其受体、信号转导分子和调控蛋白等。这些蛋白与鼻咽癌的发生密切相关。研究表明，运用RNA干扰手段抑制鼻咽癌相关的原癌基因编码的ras基因、e?myc基因的活性，可成功地抑制人鼻咽癌细胞的体外增殖［11］。Raf?1是致癌基因，在细胞信号转导通路“Ras?Raf?1?ERK? MADK"中起中枢作用。刘立中等［12］构建了三个质粒，通过脂质体转染人鼻咽癌细胞株HNE1，用RT?PCR分析Raf?1基因的mRNA的表达量减少，流式细胞仪检测细胞调亡率增加，达到65%。因此，应用RNAi技术抑制鼻咽癌相关基因的表达，有望达到抑制鼻咽癌细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的目的。

    在鼻咽癌患者中表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor, EGFR)表达阳性率明显高于对照组，并且肿瘤分化越差，EGFR表达阳性率越高；鼻咽癌颈淋巴结转移者的EGFR表达明显高于无颈淋巴结转移者［13，14］，表明EGFR与鼻咽癌的发生、癌细胞分化和肿瘤进展有一定关系。并有研究表明，利用将EGFR特异性siRNA转染的鼻咽癌低分化细胞株5?8F，通过流式细胞仪检测发现能够诱导细胞周期停止在G1期，降低细胞生长速度［15］。提示RNAi能下调鼻咽癌细胞的EGFR表达，达到抑癌作用。

    3.3  凋亡抑制基因与RNA干扰  bcl?x基因，属于bcl?2家族的新成员。因其mRNA剪切方式的不同，可产生两个基因产物：长型bcl?xl与短型bc1?xs。bcl?xl和bcl?xs功能互为相反，前者与bc1?2功能相似，能抑制多种因素诱导的细胞凋亡；后者则促进细胞凋亡。我们的研究发现，鼻咽癌细胞bcl?xl表达异常增加，而bcl?xs基因不表达［16］。Li等［17］体外合成针对人bcl ?xl基因的siRNA，并转染鼻咽癌CNE?2Z细胞株。分析结果为，CNE?2Z细胞中各siRNA转染组bcl?xl mRNA表达水平可下调10% 70%。CNE?2Z细胞增殖抑制率和凋亡率均在一定剂量范围内随浓度的增加而增加，具有剂量依赖性。但是，将pmU6?sibclD重组质粒转染到人鼻咽癌CNE?2Z细胞株，在转染后12 48?h，其重组质粒表达的短发夹状RNA（shRNA）能使bcl?xL mRNA下降90% 99%，同时降低bcl?xL翻译的蛋白表达水平［18］。虽然两个实验研究的数据存在一定差异，但都证实了RNA干扰能有效地抑制bcl?xL mRNA表达，为质粒介导的RNAi技术运用于鼻咽癌的基因治疗提供了一定的理论依据。

    3.4  VEGF与RNA干扰  肿瘤血管形成是肿瘤生长和转移的主要因素。VEGF作为有力的丝分裂素及血管渗透性剂，其主要生物学功能有：（1）选择性地增强血管内皮细胞有丝分裂，刺激内皮细胞增殖并促进血管形成；（2） 升高血管尤其是微小血管的渗透性，使血浆大分子外渗沉积在血管外基质中，为肿瘤细胞的生长和新生毛细血管网的建立提供营养。血液中VEGF水平在人类的多数肿瘤中是一种有用的预测因子。VEGF在67％的鼻咽癌患者中过度表达，VEGF的高表达与鼻咽癌的复发率高及患者的生存显著相关［19］。近来有学者用ELISA法测定VEGF siRNA转染后24?h，36?h对鼻咽癌细胞CNE细胞株(昆明细胞库提供)内VEGF的抑制作用［20］，结果显示，在转染后24h其抑制率达40％，转染后36?h，VEGF siRNA在鼻咽癌上皮样细胞系中几乎完全抑制VEGF的分泌。HE切片则表明，VEGF siRNA组裸鼠肿瘤细胞有大面积坏死灶，癌细胞周围间质水肿明显。对照组肿瘤细胞生长良好，坏死区少见，形态正常，无塌陷。因此通过RNA干扰VEGF，有可能影响鼻咽癌血管的生长和原发瘤的生长与浸润，对鼻咽癌的治疗有非常重要的意义。

    3.5  端粒酶与RNA干扰  端粒酶在肿瘤的发生中有重要意义。在恶性肿瘤中，端粒酶活性明显增高，以延长端粒，弥补因细胞分裂而造成的端粒缩短，从而使细胞无限增殖恶化。而端粒酶逆转录酶hTERT被普遍认为是端粒酶的催化亚基，是合成端粒酶全酶的限速因素［21］，该基因与肿瘤的关系更为密切。研究表明，鼻咽癌端粒酶阳性率在80％以上，而在正常鼻咽黏膜中，端粒酶活性呈阴性，提示端粒酶与鼻咽癌发生发展密切相关［22］。当抑制端粒酶活性时，可明显抑制肿瘤细胞的生长，并可诱导细胞凋亡［23］。有研究针对hTERT基因设计了小干扰RNA(siRNA)序列，脂质体转染鼻咽癌CNE?2细胞结果显示，hTERT的mRNA表达水平分别下调10％ 70％,蛋白表达水平有不同程度地降低，细胞周期在G0 G1期受阻，并不同程度地诱导细胞凋亡［24］。其机制可能为，RNA干扰下调hTERT基因的表达，降低端粒酶的活性，从而抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其凋亡。

    4  展望

    RNA干扰已成为当今研究的热点，国内外应用RNA干预技术治疗鼻咽癌的机制正在研究中。然而，其他与鼻咽癌相关的基因，例如抑癌基因nm23、p53、Rb等是否受RNAi的作用，还有待进一步研究。随着RNA干扰技术不断成熟和鼻咽癌发病机制研究的深入，RNA干扰可能为鼻咽癌的治疗和预防打开新的篇章。

【】
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