体外构建含细胞组织工程角膜基质的方法
【摘要】 目的：研究体外构建组织工程角膜基质的方法。 方法：用去垢剂联合酶的方法脱细胞处理猪角膜基质, 在去细胞猪角膜基质材料上接种体外培养的兔角膜基质细胞，并将兔角膜基质细胞进行PKH26荧光标记，在体外构建组织工程角膜基质。用倒置荧光显微镜；HE染色光学显微镜；扫描电镜观察。结果：利用异种去细胞角膜基质组织为支架材料而构建的组织工程角膜基质具有近似正常角膜基质的三维立体结构。 结论：以去细胞猪角膜基质材料为支架，利用组织工程技术可成功的在体外构建出含细胞的组织工程角膜基质组织。
【关键词】 组织工程 角膜基质 构建
In vitro construction of cellular tissue engineering corneal stroma
Abstract AIM: To study the in vitro construction process of cellular tissue engineering cornea stroma. METHODS: Porcine cornea stromata were processed by serial digestion of trypsin, Dnase and Rnase. Then rabbit corneal stroma cells were raised in it, marked by fluorchrome pkh26. Tissue engineering cornea stromata were constructed in vitro. Inverted fluorescence microscope, HE staining light microscope and scanning electron microscope were used in the observation.RESULTS: In vitro constructed tissue engineering cornea stroma had the similar three diamension construction with the normal corneal stroma.Conclusion: Acellular porcine cornea stroma materials can be used as carrier material to construct tissue engineering cornea in vitro.
· KEYWORDS:tissue engineering;corneal stroma;construction
0引言
角膜供体的匮乏限制了角膜移植的广泛开展，构建工程化角膜来替代供体角膜材料，为临床提供更丰富的移植材料是目前组织工程角膜研究的热点。如何构建组织工程角膜基质[1]是重要的一环。基质层是构成角膜的主要部分，占角膜厚度的90％，主要由胶原纤维、角膜基质细胞和细胞外基质组成。在板层角膜移植手术中供体角膜基质层对病理转归发挥了主要的作用[2]，故体外构建工程化角膜基质具有重要的临床应用价值。
1材料和方法
1.1材料 取新鲜的York猪全层角膜。用Tris-EDTA（10m mmol/L Tris，5m mmol/L EDTA）过夜后，10g/L去垢剂Triton 40C再过夜。2.5g/L胰酶37℃消化4h后，再用1∶1 000的DNA酶-RNA酶37℃消化4h脱细胞处理，10g/L Triton过夜。50mmol/L Tris-EDTA、三蒸水震荡清洗3遍，将全层角膜片切分为0.2mm厚的板层角膜片。-20℃冻干。Co60照射灭菌-20℃保存。取1mo龄的新西兰幼兔的新鲜角膜，用含二抗的PBS液仔细冲洗，5min×3次。再将角膜全层剪下，去除虹膜组织、角膜上皮、内皮层，用含二抗的PBS液再次冲洗，5min×3次。将角膜组织剪成1mm3的组织碎块，加入胶原酶625ku/L消化30～60min后，终止消化，离心，弃上清液，加入DMEM培养液并接种于培养瓶中，放置37℃孵箱内培养，每3d换液1次。待细胞汇合后，将原代培养的角膜基质细胞用胰蛋白酶消化后吹打成细胞悬液，种植在盖玻片上，加入DMEM培养液1mL放置于孵箱中孵育24~48h，使细胞长满玻片后丙酮固定15min，将固定好的细胞爬片用0.01mol/L PBS缓冲液洗3次，每次5min；2.5mL/L Triton X-100处理10 min；PBS震洗3次，每次5min；30ml/L H2O2封闭内原性过氧化物酶10min；PBS震洗3次；滴加一抗，Ck（1 : 150），Vim（1 : 50），同时设空白对照，PBS代替一抗；37℃，150min；以下操作按免疫组化试剂盒要求进行。滴加DAB室温下显色5 ~ 10min，PBS冲洗终止显色反应。逐级脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。将第3代兔角膜基质细胞用胰酶消化成单细胞悬液，取2×107细胞于锥形离心管中，根据PKH26操作说明书进行标记，简单步骤如下：将细胞用PBS清洗后，离心形成松散细胞团块，以试剂盒内稀释液1 mL重悬；将 1.5μL PKH26染料稀释后加入细胞中快速均匀混合，25℃孵育2~5min（定时颠倒离心管保证充分混匀）；加入等量血清终止反应，孵育1min；含血清完全培养基离心清洗细胞，至少3次；将细胞按所需浓度重悬，接种。
1.2方法 将PACM在超净台内修剪为直径约12mm圆片放入24孔板内，用DMEM培养液浸泡1~ 2d，弃去培养液，备用。将标记有PKH26兔角膜基质细胞以4×106/cm2密度接种在备用的PACM上，加入DMEM培养液，放置37℃，50mL/L CO2孵箱内培养，1~ 2d换液1次。培养5d取材，作HE染色光学显微镜观察；扫描电镜观察；冰冻切片荧光显微镜观察。
2结果
兔角膜基质细胞消化后1~ 2h贴壁，细胞伸展呈梭形，胞浆清亮，核居中。3~ 5d细胞形成密集单层，排列非常整齐，呈漩涡状。细胞免疫组化结果：波形丝蛋白染色阳性（图1），角蛋白染色阴性，证明细胞无上皮细胞的污染，是单一的角膜基质细胞。组织学观察：兔角膜基质细胞伸展呈梭形，在去细胞猪角膜基质材料表面紧密帖附（图2A）。扫描电镜观察：兔角膜基质细胞呈多角形伸展于去细胞猪角膜基质材料的表面，细胞和材料黏附紧密（图2B）。可见去细胞猪角膜基质材料上附着呈红色荧光的兔角膜基质细胞（图2C）
图1 体外培养兔角膜基质细胞波形丝蛋白染色阳性
3讨论
组织工程角膜基质构建成功的关键是应用理想的载体作为细胞外基质来种植角膜基质细胞，形成近似体内的正常结构。这种载体应支持细胞生长，促进细胞融合，具有良好的组织相容性。猪角膜基质与人角膜基质结构相似，有完整的细胞外基质、基底膜、前弹力层和基质，存在多种生长因子，可诱导调节细胞的生长、繁殖、分化、增生。有研究发现角膜基质免疫原性很低，在细胞免疫方面，角膜基质仅占1.62%[3]。Li等[4]研究发现角膜基质和角膜缘上皮、角膜成纤维细胞间存在细胞因子调控。Friend等[5]、吴静等[6]分别在猪角膜基质上培养出角膜上皮细胞，使其在体外形成近乎生理状态下的角膜上皮组织。Amano等[7]在猪角膜基质上培养人角膜内皮细胞并移植成功。我们发现去细胞猪角膜基质材料具有三维空间网格状结构，良好的生物相容性[8]，而且有较好的效果。以它为支架接种、培养兔角膜基质细胞构建出含细胞的组织工程角膜，经扫描电镜证实含细胞的组织工程角膜具有三维空间网格状结构，与正常角膜基质结构相近，可提供给角膜基质细胞充足的养份和物质交换空间，利于细胞生长、增殖和分化。角膜基质细胞在去细胞猪角膜基质材料上贴附生长良好。荧光显微镜观察可见去细胞猪角膜基质材料上附着呈红色荧光的兔角膜基质细胞，进一步说明了含细胞的组织工程角膜基质内含有的角膜基质细胞具有活性。因此，本实验在体外成功构建了含有活细胞的组织工程角膜基质。
【】
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2陈冬红,袁南荣.实验性全厚板层角膜移植术的免疫组织学研究.眼科新进展,1999;19:169-171
3王智崇,葛坚,徐锦堂,陈家祺.角膜不同组织免疫原性分析.中华眼科杂志,2002;8(9):535-538
4 Li DQ, Tseng SC. Three patterns of cytokine expression potentially involved in epithelial -fibroblast interactions of human ocular surface. J Cell Physiol ,1995;163(1):61-79
5 Friend J, Kinoshita S, Thoft RA, Eliason JA. Corneal epithelial cell cultures on stromal carriers. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1982;23(1): 41—49
6吴静,徐锦堂,赵松滨.培养角膜上皮移植的实验研究.实用眼科杂志,2001;19(3):178-179
7 Amano S. Transplantation of cultured human corneal endothelial cells. Cornea ,2003;22(7):66-74
8张超,金岩,胡丹,聂鑫,刘源,雷娟.异种脱细胞角膜材料的生物相容性研究.国际眼科杂志,2005;5(2):250-253
