糖尿病视网膜病变发病机制中VEGF与PEDF的研究进展
【摘要】 糖尿病视网膜病变（diabeic retinopathy, DR）是糖尿病最常见和最严重微血管并发症之一，其基本病理改变是血—视网膜屏障(blood retinal barrier, BRB)破坏，新生血管形成。后期新生血管膜收缩牵拉视网膜脱离。DR的发病机制十分复杂，至今尚未完全阐明。任何病理改变在本质上均是体内动态平衡的失调，新生血管的形成亦然，血管刺激因素增强和（或）抑制因素减少使两者平衡失调即所谓的“血管生成开关”。血管内皮生长因子（vascuar endothelial growth factor, VEGF）和色素上皮衍生因子（pigment epithelium - derived factor, PEDF）作为血管生成因子与血管抑制因子的一对典型代表，在糖尿病视网膜病变中的作用已逐渐被人们认识。本文就二者在糖尿病视网膜病变中作用的研究进展做一综述。并为DR的相关药物提供思路。
【关键词】 糖尿病视网膜病变 ；VEGF ； PEDF
Perspectives on VEGF and PEDF in the pathogenesis of diabetic retinopathy
Abstract Diabetic retinopathy is one of the most frequently and the most severe micrangium complications of diabetes mellitus, the fundamental pathology characteristic of DR is breakdown of the blood-retinal barrier and neovascularization . In the later stage of DR, the formation of the epiretinal membrane, which may tractates the retina and produce detachment of the retina, results in progressive deterioration of vision. The pathogenesis is very complex and has not been elucidated completely. Retinal neovascularization results from both increasing of vascular stimulating factor and reducing of vascular inhibiting factor. As the classic represents of vascular stimulating and inhibiting factor, the function of vascular endothelial growth factor(VEGF) and pigment epithelium-derived factor(PEDF) in pathogenesis of DR has been recognized gradually. This article summarized the function of both VEGF and PEDF and provided ideas for medicine therapeutic to DR.
· KEYWORDS:diabetic retinopathy; VEGF; PEDF
0引言
糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）是糖尿病最常见和最严重微血管并发症之一，它已成为大多数发达国家工作年龄人群致盲的首要原因。在，目前有超过5 000万糖尿病患者，并以每年10%的速度增加，因DR而致盲者已达7万多人。 DR的患病率随糖尿病病程的延长而增加，5a内DR患病率为44.4%，7a后为56%[1]，世界范围内糖尿病患者人数的增加提示糖尿病视网膜病变将来依然是视力丧失和视功能损害的主要原因。近年来，随着细胞生物学和分子生物学技术的深入研究，细胞因子在DR中的作用已被学者们广泛关注和研究。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor ,VEGF）及色素上皮衍生因子（pigment epithelium—derived factor, PEDF）作为与DR联系最为紧密的细胞因子之一，逐渐为人们所重视，现将此方面研究成果综述如下。
1 VEGF的生物学特性及其与糖尿病视网膜病变的关系
1.1 VEGF的生物学特性 VEGF是血管内皮细胞特异的促有丝分裂素，对视网膜色素上皮细胞也有促有丝分裂作用。但是与其他内皮细胞促有丝分裂素如成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF）不同的是，VEGF可以增加血管渗透性。1983年，研究肿瘤生长微环境时，研究者发现了一种肿瘤血管渗透因子（tumor vascular permeability factor,VPF）[2]。1989年，Ferrara和Henze从牛垂体滤泡细胞培养液中分离出一种内皮细胞特异的促有丝分裂素，把它命名为VEGF[3]，此后用逆转录脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid, cDNA)克隆技术证明，VPF和VEGF是同一种物质。在生理性血管生成过程中VEGF代表了一个关键的限速步骤，在过去的数十年里，VEGF在调节血管形成中的作用成为研究的目标，并取得了重大进展。VEGF基因位于6b21.3，有8个外显子和7个内含子构成，由于单基因剪切的位置不同，VEGF有4种亚型：121，165，189，206。VEGF165是主要亚型。VEGF的生物学效应是通过与其特异性受体结合而发挥作用的。VEGF受体主要有fms-样酪氨酸激酶（fms-like tyrosine kinase, Flt-1）和含激酶插入区受体（kinase insert domain containing receptor, KDR） 。它们与细胞表面相应受体,VEGFR-1（Flt-1）,VEGFR-2（KDR/Flt-1）和VEGFR-3（Flt-4）结合后，受体被激活接着引发靶细胞的细胞内信号转导，细胞增殖、迁移或改变基因表达。VEGF广泛分布于人和动物体内的脑、肾、肝、眼等多种组织，正常情况下。在眼部视网膜的周细胞、视网膜色素上皮细胞和内皮细胞均可产生较低水平VEGF，生理状态下，VEGF在眼部呈低表达状态，这对维持眼部血管的完整是必要的。然而过度表达将促进血管的增殖。
1.2 VEGF与糖尿病视网膜病变的关系 糖尿病最终导致DR的确切病理机制尚未完全明了，造成视网膜血管渗漏和新生血管生成的始动因素是缺氧，而缺氧通过多途径、多步骤引起VEGFmRNA表达增强，临床及动物实验均已证实DR个体眼内特别是视网膜局部存在高水平的VEGF。DR动物模型显示视网膜局部组织末端糖基化产物（advanced glycation end products,AGE）堆积，肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system,RAs）系统活化、蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）激活。而其导致DR发生、均是通过VEGF-VEGFR系统实现的[4-6]。AGE可增加牛视网膜内皮细胞（bovine retinal endothelial cell, BRECs）中的PKC活性和VEGF基因启动子与核因子κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）的连接活性， 既而VEGF表达增加[4]。血管紧张素Ⅱ（angiotesinⅡ, AⅡ）刺激周细胞分泌VEGF，上调内皮细胞VEGFR2的表达从而促进血管内皮细胞的增殖[7-8]。视网膜局部高水平的VEGF作为一种内皮细胞特异的血管生成与渗漏因子。首先，它参与了糖尿病视网膜病变中视网膜微血管渗透性的改变，造成血—视网膜屏障(blood retinal barrier, BRB)的破坏，引起视网膜渗出、出血，及水肿（糖尿病性黄斑水肿）[9]，血管内大分子物质如纤维蛋白进入细胞外基质中形成纤维蛋白凝胶，允许和支持新生血管和基质细胞的内向生长。它对血管的这种渗透增强作用的完成是通过一种所谓的内皮微小松弛因子的作用而产生的。在研究VEGF引发微血管渗漏的机制中，PKC途径逐渐明朗，玻璃体腔内注射VEGF可使PKCα PKCβⅡ PKCδ亚型发生膜转位，造成视网膜血管渗漏，而PKC抑制剂可减弱此作用[10]。再者，VEGF作为血管内皮细胞特异的促有丝分裂素，与细胞表面相应受体结合后，激活细胞内的一系列信号转导途径，造成内皮细胞增殖、迁移、最终形成新生血管腔。Funatsu等用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）方法检测出增殖性糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy, PDR）稳定与恶化的患者玻璃体液中VEGF差异有统计学意义，而两者血清中的差异无统计学意义，玻璃体中VEGF水平与视网膜新生血管密度显著相关[11]。提示VEGF是与PDR新生血管形成关系最为紧密的一个因子。其次，VEGF上调视网膜局部细胞间黏附分子-1（intercellar adhesion molecule-1, ICAM1）的基因表达增加视网膜血管ICAM-1的mRNA和蛋白质水平，从而造成视网膜白细胞的淤滞和BRB破坏，VEGF的同构体中VEGF164(165)诱导ICAM-1表达升高的潜能至少是VEGF120的两倍。VEGF抑制剂抑制视网膜ICAM-1的表达、白细胞淤滞和BRB的破坏，从而减少视网膜微血管渗漏[12-14]。临床试验更加证实，糖尿病视网膜病变患者特别是PDR患者视网膜组织、及眼内液中VEGF水平增高。活动期DR病例VEGF水平高于静止期DR病例[15-17]。由此可见，VEGF是DR发生发展过程中一个关键性的调节因子，它的作用涉及DR发病的多步骤、多途径，人们广泛认为，抑制VEGF表达，VEGF与受体结合，及VEGF下游信号途径如PKC抑制剂，均可作为治疗DR的靶方向。
VEGF发挥其生物学作用是通过与细胞表面VEGFR结合而实现的，高糖条件下分别培养视网膜血管内皮细胞和大脑来源的血管内皮细胞，结果显示，二者表达相同水平及类型的VEGF，而视网膜血管内皮细胞表面VEGFR的表达却明显高于大脑来源的血管内皮细胞，说明视网膜微循环对VEGF更加敏感[18]。推测这与视网膜特殊的微环境有关。Konopatskaya等[19]新近动物实验表明，VEGF基因由于不同的剪接（羧基末端的氨基酸顺序不同）而表现出两种类型：促血管生成家族VEGFxxx和抗血管生成家族EGFXXXb。促血管生成家族可促成眼内新生血管生成。抗血管生成家族在糖尿病视网膜病变患者体内下调，其中第一个被分离出来的成员就是VEGF165b，而且证明眼内注射重组人VEGF165b可显著减少动物模型的视网膜前新生血管，但不影响生理性血管的形成。由此推测，维持VEGF此种亚型的平衡可以作为糖尿病视网膜病变的一种新策略。但DR患者眼局部VEGF这两种亚型的表达及分布尚需进一步的研究。
2 PEDF的生物学特性及其与糖尿病视网膜病变的关系
2.1 PEDF的生物学特性 PEDF是含418个氨基酸，分子量约为50kDa的糖蛋白，位于染色体17p13，它属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族，但无抑制蛋白水解酶的活性作用[20]。PEDF最早由Tombran-Tink等从人胎儿视网膜色素上皮细胞培养调理液中纯化分离出来，能诱导培养Y79视网膜母细胞瘤细胞的神经元分化，具有神经营养作用。PEDF由视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium, RPE)旁分泌至视网膜感光细胞间基质，对视网膜的分化起重要作用。胎儿和年轻人的RPE有较高的PEDF基因表达，而衰老的RPE细胞中PEDF基因表达下调。在视网膜内核层、神经节细胞层、脉络膜、睫状体、角膜内皮细胞和上皮细胞及光感受器均有PEDF存在。Dawson等[21,22]1999年首次发现PEDF还具有很强的抑制血管作用，正常人的房水、玻璃体腔中有较高浓度的PEDF，可能是维持角膜玻璃体等眼内组织无血管结构的主要原因。认为PEDF是一种双重作用的因子，不仅具有神经营养作用，还具有抗血管生成的作用。
2.2 PEDF与糖尿病视网膜病变的关系 随着DR发病机理的多方向及深入研究，血管抑制因子的作用已被研究者所重视。PEDF被认为是最有效的天然血管抑制因子，近年来人们对其进行了较为广泛的研究，并且一致认为，在DR中PEDF是一个保护性因子。抽掉玻璃体中的PEDF，抗血管生成的活性消失，表现出刺激血管生成的活性增强。DR的最早病理改变为视网膜微血管周细胞丧失及功能障碍，细胞培养证明，AGEs损伤培养的周细胞， PEDF可保护周细胞免受AGEs的损伤，这一过程是通过PEDF的抗氧化特性来实现的。AGEs或活性氧族（reactive oxygen species,ROS）可抑制视网膜周细胞内PEDFmRNA的表达，造成PEDF水平下降，而PEDF水平的下降可使氧化应激诱导的周细胞凋亡及功能障碍进一步加剧[23],从而促使DR的进展，微血管瘤形成，血管渗漏，内皮细胞增殖、移行、新生血管形成。也有研究显示，PEDF参与了调节PDR患者视网膜前新生血管膜的形成[24]，这说明，PEDF的作用贯穿与DR病程的全过程。大量临床实验表明DR患者房水及玻璃体中PEDF水平低于正常对照组，PDR患者的这种趋势更加明显[15,16,25]。造成DR患者眼局部PEDF水平下降的原因尚未完全明确：体外细胞培养提示，高葡萄糖可直接下调RPE细胞的PEDF表达。学者们对PEDF抑制血管生成的机制进行了大量的研究，动物实验表明，静脉注射PEDF可抑制AGE介导的VEGF所引发的血管渗漏[26]，全身及玻璃体腔注射人重组PEDF可明显抑制高浓度氧或缺血诱导的视网膜新生血管形成。细胞培养亦证明，PEDF可抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖与迁移[27,28]。这些研究明确了在DR的早、中、晚期PEDF的保护性作用持续存在，糖尿病视网膜局部PEDF水平的减少削弱了这种保护性作用，为DR发生创造条件或促使DR发生、发展及恶化。
PEDF不仅可以抑制新生血管的形成，还可逆转已经形成的新生血管。Mori等[29]用VEGF转基因鼠模型及激光损伤所致的CNV模型进行实验，2wk后玻璃体内或视网膜下注射腺病毒载体介导的PEDF（AdPEDF）对照组用(AdNull),结果显示，PEDF组新生血管显著退行，内皮细胞显著凋亡。更有意义的是PEDF的这种抑制血管生成的作用是具有选择性的，它可以抑制生成病理性新生血管，但不影响生理性血管的形成。基因转染的鼠模型表明，高于生理浓度3.5倍的内源性PEDF对新生鼠视网膜血管形成和分化不会造成明显或持久的影响[30]。因此， PEDF治疗视网膜新生血管性疾病有广阔前景。
3 VEGF与PEDF在DR中的相互作用及影响
血管的发生是由血管刺激因子和血管抑制因子的平衡所控制，正常组织中，血管抑制因子影响占据优势，因此不会发生新生血管，病理状态下如：PDR，肿瘤发生时，血管刺激因子增强或/ 和抑制因子减弱，导致新生血管产生。Zhang 等[31]的实验证明，作为主要血管刺激因子的VEGF和潜在的血管抑制因子PEDF之间的平衡对调节血管渗漏与新生血管的形成是至关重要的。现已证明，VEGF与PEDF之间存在一种互逆的调节，PEDF可以大大下调视网膜血管内皮细胞和Müller细胞VEGF的表达,在Müller细胞中，用siRNA使PEDF基因沉没，可以造成VEGF在mRNA水平及蛋白质水平明显升高，说明PEDF是一种内源性的VEGF的负性调节剂。更进一步的研究表明，缺氧不仅可诱导VEGF启动子活性增加，还可诱导缺氧诱导因子（hypoxia inducing factor, HIF）核转位及促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化，而以上过程可被PEDF抑制。这说明PEDF抑制VEGF发生在转录水平。又有体外实验表明，PEDF可与VEGF竞争VEGFR-2，这显示出了PEDF的又一作用机制。另一方面，VEGF明显下调PEDF的表达。并由此推测，糖尿病患者视网膜局部VEGF表达增加至少部分归因与PEDF水平的减少，既而造成血管渗漏和新生血管形成。所以，恢复血管刺激因子与血管抑制因子的平衡状态，是DR的关键所在。
总之，DR的发生是一个很复杂的病理过程，它是多因素，多阶段作用的结果。在引起DR的多方面因素中，根本的原因是机体糖代谢紊乱与微循环障碍，视网膜局部血管刺激因素与血管抑制因素之间的平衡破坏是引发血—视网膜屏障破坏、新生血管生成的直接原因。在临床上，有效的视网膜激光光凝及玻璃体手术已成为PDR常规治疗手段。但这些方法对眼局部均具有不同程度的损伤性。目前，研究的热点逐渐从血管生成因子转移到血管生成因子与抑制因子的网络调控上。在DR的药物干预方面，旨在寻求调节关键生长因子的药物性治疗，抑制VEGF的表达，VEGF受体拮抗剂，VEGF的细胞内信号转导以及重塑VEGF与PEDF之间的动态平衡成为研究的靶方向，同时，PEDF具有抑制病理性新生血管和神经营养双重生物功能可以在治疗疾病的同时保护视功能，但是，DR有关VEGF和PEDF药物治疗的研究还处于早期阶段，还需要大量基础及药理研究来证明其临床有效性和安全性。
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