视网膜色素变性的视网膜移植治疗
【摘要】 视网膜色素变性是一种遗传性致盲性眼病，发病率较高，危害性较大。临床上方法很多，但尚无一种理想有效的方法。传统中医治疗，药物治疗，近几年兴起的基因治疗及视网膜移植治疗各有特点。其中视网膜移植治疗是近几年研究的热点，并且被认为是最有前景的治疗措施。现就视网膜移植治疗视网膜色素变性的相关研究进展作一综述。
【关键词】 视网膜色素变性；视网膜移植；视网膜色素上皮
0引言
视网膜色素变性（retinitis pigmentosa, RP）是一种遗传性致盲性眼病，发病率约1/3 500[1]。具有四种主要遗传方式：常染色体显性遗传（ADRP），常染色体隐性遗传（ARRP），X性连锁遗传（XLRP）和双基因遗传。另外，还有线粒体遗传及无遗传可循的散发形式。典型RP呈进行性，多发于青少年，早期表现为夜盲和周边视野进行性缩窄，随后可丧失色觉，最后导致失明[2]，临床表型与遗传基础并不存在严格的对应关系，具有遗传异质性和临床异质性。传统药物治疗及中医治疗，效果不甚理想。如应用AMP及钙离子拮抗剂；中医采用活血化瘀为主的药物，辅以针灸，推拿和穴位注射等疗法。近几年发现生长因子可调节调亡，延缓感光细胞变性过程，促进其再生，可为视网膜移植提供良好条件[3]。基因治疗是近几年新兴起来的一种治疗方法。治疗的途径有体内和体外两种。体内基因治疗最常用的“载体—基因”介入途径是视网膜下腔注射，所用的载体分为病毒载体，非病毒载体两大类；体外基因治疗则是把经过转基因后的靶细胞移植到眼内，使外源性基因的表达与视网膜移植手术联合应用。以上的治疗方法效果均不理想，近几年，视网膜移植技术的研究和开展揭开了视网膜色素变性治疗史的新的一页。1985年，Gouras等[4]首次报道了将体外培养的RPE细胞移植到猴的Bruch膜上获得成功；1996年，Das等[5]首次将视网膜移植应用于临床。以后关于这方面的研究迅速开展起来，现将视网膜移植术治疗视网膜色素变性的研究进展作一综述。
1视网膜移植的病理和细胞分子学基础
1.1病基础 RP患者视网膜组织病理学和免疫细胞化学的研究证实，RP原发于视网膜感光细胞，并以感光细胞变性死亡为主要病理特征。感光细胞（photoreceptor cell, PRC）包括视锥细胞，视杆细胞及视网膜色素上皮细胞（RPEC）。是位于视网膜最外面的两层细胞。1997年，Santos等[6]对RP患者的视网膜作了形态学分析，研究结果发现，尽管视网膜各层的细胞丢失均有统计学意义，但内层视网膜神经原仍保持组织完整性。这是视网膜移植治疗术的前提。
1.2细胞分子学基础 感光细胞移植的治疗机制可能有两个，一是通过移植的正常视杆细胞替代变性的视杆细胞，以重建视网膜神经结构。二是与视杆细胞产生可溶性因子挽救视锥细胞有关。
1.2.1组织细胞学基础 以往研究[7-9]证明，移植细胞可以重建视网膜变性的光感细胞层，发挥感光细胞的作用，移植细胞可与宿主视网膜形成功能连接。研究发现[10]，RPE细胞对于神经视网膜的发育具有重要作用，带有RPE细胞的移植物使视网膜细胞排列更整齐，形成血管及细胞外基质，移植物中含有Müller细胞时，移植效果更好。
1.2.2分子学基础 近年来，克隆分析证实局部微环境中的可溶性因子影响视网膜前体细胞的发育和分化，视网膜前体细胞在特定的可溶性因子的作用下能诱导分化为感光细胞。视网膜局部损伤可促进神经营养因子释放，如睫状神经营养因子（CNTF），成纤维细胞生长因子（bFGF），转化生长因子及血小板源性生长因子（PDGF）等。移植的视网膜干细胞融合于损伤的视网膜而不融合于正常视网膜，与神经营养因子有关[11]。视网膜色素变性是一种遗传性疾病，基因突变或缺失导致感光细胞变性或丢失，基因转移后培养RPE细胞，移植到视网膜可以保护感光细胞[12]。
1.3免疫学基础 RPE细胞基础性表达I类MHC抗原，而不表达II类MHC抗原，而免疫学认为细胞移植的免疫应答主要取决于II类MHC抗原，故视网膜组织具有较低的免疫原性。视网膜下腔没有淋巴系统，并被血眼屏障和RPE细胞间紧密连接相隔，故认为视网膜下腔存在有限度的免疫赦免，即抗原特异性细胞免疫和体液免疫反应的抑制[13]。故将视网膜细胞移植到视网膜下腔是一种安全的移植方法[14,15]。
2视网膜移植技术
2.1组织细胞来源 可来源于胚胎视网膜或尸体视网膜，也可经体外细胞培养后再移植到RP患者。如在体外培养RPE细胞，然后移植到视网膜色素变性的部位[16]。移植物可为新鲜的视网膜组织细胞，也可为冷冻保存的组织。Optisol可用于保存胚胎视网膜组织用于移植[17]。研究表明[18]，冷冻保存的视网膜组织能够成功地被移植到鼠视网膜，并存活，发挥其功能。
2.2移植类型
2.2.1 RPE细胞移植 主要成分为游离状态的细胞移植和单层细胞片植入。游离细胞移植创伤较小，细胞能均匀分布，但不能维持正常极性。单层细胞移植是将培养的单层细胞片切成适当的几何图形使用，它能维持正常极性，但手术难度大，RPE细胞和感光细胞具有相互依存性，RPE细胞对脱落的外节盘发挥周期性的吞噬作用，防止其堆积，影响感光细胞的正常功能。RPE细胞还对感光细胞具有营养保护和支持作用[19,20]。实验研究发现[19]，视网膜色素上皮细胞移植可推迟和减少视网膜细胞随年龄增长而发生的凋亡。
2.2.2感光细胞移植 主要是以游离细胞悬液，视网膜组织颗粒和感光细胞片形式植入。游离细胞悬液以酶消化法得到，但此法分离所得到的细胞悬液破坏了感光细胞层的正常组织结构和细胞极性。于是Gouras等[21]就将视网膜制成组织颗粒，进行移植研究，认为此法可减少对细胞结构和排列的破坏，有利于移植物的生长。感光细胞移植片是将供体视网膜完整的分离出，然后用激光或组织切削机取得单纯的光感受器细胞层，可直接按移植该片或经储存培养后进行移植[22]。
2.2.3带有RPE细胞的神经视网膜移植 视网膜变性不仅损害感光细胞，RPE细胞也受到损害，晚期，内层神经视网膜受到损害。近来，一些实验开展了带有RPE细胞的神经视网膜技术，Ghosh等[7,23]作了在视紫质转基因猪的全层视网膜移植的动物实验。结果证明全层神经视网膜可以被移植到感光细胞变性的大动物宿主，移植过程相对安全，移植物至少4mo内生存良好，形成大量感光细胞，可很好保护内层视网膜，这在重建视网膜变性的光感细胞方面很重要。Radtke等[24]研究发现胚胎视网膜能够与RPE一起移植，至少存活6mo而没有明显排斥反应。Seiler等[10]研究发现带有RPE的移植物使细胞排列更整齐，易于形成血管及细胞外基质。
2.3移植方法
2.3.1外路移植法 外路法系指经巩膜，脉络膜将移植物植入视网膜下腔。此法定位准确，对视网膜无明显损害，可避免移植的RPE细胞进入玻璃体而引起增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）。
2.3.2内路移植法 经角膜或睫状体平坦部切口入路，再直视下确定移植部位并将微细吸管刺入视网膜神经上皮下，植入移植物。内路法较外路法精确可靠，但有引起PVF的可能。随着玻璃体视网膜手术技术的发展，内路法的并发症已明显降低。特别是术中增加了玻璃体切割技术，直视下更准确选择移植部位并植入移植物，进一步减少了术后并发症的产生。
2.4移植术后的形态观察
2.4.1移植物标记法 1995年，Seiler等[25]报道了用来区分供体和受体视网膜组织细胞的两种方法：BrdU标记法和转基因法，可很好的区分供，受体组织细胞。1997年，Diloreto等[26]报道了用荧光素作为供体视网膜组织的染色剂，是一种短期有效的染色剂，是无毒的，对细胞生存力和分化无明显影响，可画图表示移植物的分布区域，并可进行扫描拍片。2003年，Warncke等[27]提供了一种更好的标记方法：就是用Alu序列的ISH作为标记，这种方法与以往方法比较，其突出优点是能清楚的辨认移植细胞而不干扰细胞的新陈代谢和生物学行为，易于显影，甚至单个移植细胞也能被识别，并且它们的生活状态在短期或长期研究中均能观察到。用这种方法，我们可以保证供体细胞准确的注入视网膜下腔，结合免疫组化法，供体细胞也可与吞噬细胞区别开来，这些ISH方法的应用对于RPE移植后的研究具有重要价值。
2.4.2形态学观察 标记的宿主细胞和供体细胞比较容易区分，可采用光学显微镜，显微镜等进行形态学观察，荧光标记法，还可进行荧光扫描拍片观察。显微镜观察结合成像技术可记录细胞的生存状态及形态学特点，观察供体视网膜细胞与宿主视网膜细胞的整合情况。
3视网膜移植的效果
3.1影响视网膜移植效果的因素
3.1.1供体方面的因素
3.1.1.1供体组织的形状 游离细胞移植较易操作，创伤性小，但细胞不能维持正常极性，对视网膜功能恢复不明显；层细胞片移植手术难度大，但能维持正常细胞极性，减少花环形成，利于视功能恢复；颗粒状细胞移植介于前两者之间，免疫排斥反应较全层视网膜移植强。
3.1.1.2供体年龄 一般认为年轻的供体比年长的供体移植效果好。因随着年龄增长，黑色素和脂褐质的氧化毒性对RPE的正常功能的损害不断累积，使年长供者不能提供正常的移植成分[28]。
3.1.1.3细胞来源 来源于胚胎视网膜的细胞分化能力好，致敏性小，植片易于存活并与宿主组织建立连接，特别是采用早期的胚胎细胞。人类的供体最适胎龄为14～18wk[29,30]。尸体视网膜片多数来自成人，分化能力低，可能会造成排异。
3.1.2受体方面的因素 与受体视网膜损伤类型有关。视网膜损伤时间长，视网膜移植后易于形成斑痕[31]。视网膜损伤越轻，移植后视功能恢复越好。感光细胞丢失或变性，内层神经视网膜保持完整时，移植后，移植物与宿主视网膜易于建立功能联系，利于视功能恢复；如果因RPE细胞的丢失，部分感光细胞丢失，则应进行带有RPE细胞的视网膜移植，视功能的恢复可能不如仅感光细胞丢失而RPE保持完整的患者[32]。
3.2移植后的组织学变化
3.2.1感光细胞移植后的组织学变化 经过大量实验研究，发现移植的感光细胞形成了外节[33]，且与受主RPE层紧密连接在一起[7]。在受主和移植物之间的接触面可发现一层新生的突触层[34]。移植的感光细胞与宿主的双极细胞形成视网膜的典型突触连接。电子显微镜下，可看到重建的感光细胞层[8]。
3.2.2 RPE细胞移植后的组织学变化 RPE细胞移植后不但成活，并附着在受体眼的Bruch膜上，维持正常的基底与顶端的形态，而且与邻近的RPE细胞建立闭锁小带；移植的RPE不仅与受体眼的感光细胞紧密结合，而且可观察到受体眼的神经节盘膜正常脱落后被移植的RPE细胞吞噬。Litlle等[20]曾做研究，第一次证明了人类胚胎RPE细胞移植能够拯救遗传性视网膜变性的光感细胞。移植后4wk，光学显微镜下细胞记数，移植区，外核层细胞层达3～4层，每100个显微视野感光细胞核数量为34.7±2.2；未移植区或对照组外核层几近缺失，每100个显微视野感光细胞核数量为3.5±1.4。移植的RPE细胞可阻滞感光细胞变性[19]。
3.2.3视网膜干细胞移植后组织学变化 胚胎视网膜细胞移植后至少生存5mo，虽长期生存率降低，但移植细胞会分化成熟形成一近似带有一些异常结构的视网膜结构[15]。培养的视网膜祖细胞能保持不成熟状态，失去组织特异性，移植后能够整合到变性的视网膜，分化成神经原和神经角质细胞，甚至感光细胞[35]。
3.3移植后的视功能恢复状况 关于这方面的报道不多，大部分患者术后视力与术前相同，无明显改变。Das等[29]对14例RP患者进行了3a多追踪观察后，发现3例患者视力由光感变为手动；1例患者术后8mo视力由光感变为20/200，且视野为3度；还有1例患者视力由FC/15cm为FC/50cm，视野为2度。移植视网膜具有功能性的直接证据是进行电生理实验。Radtke等[36]观察的患者主觉视力改善明显且出现色觉功能，但除了1例年轻患者在术后4mo时曾出现多焦ERG反应外，其余患者在术后做多焦ERG检查时均无反应。2004年，蔡浩然等[37]对45名视网膜色素变性患者90眼术前术后进行了视锐度，自动视野计和3种视觉电生理指标（F-ERG，EOG和P-VEP）检测。结果发现，术后3～22mo，患者的视锐度得到了明显的改善，视野显著扩大，视野缺损减低。术前90眼中73眼（81.1%）的暗视F-ERG为熄灭型，术后3～22mo期间复查时，有些曾消失的F-ERG波复现，暗视F-ERG为熄灭型的眼下降至66只（73.3%）（P<0.05，t -test），一些原来残存的F-ERG波波幅增加，峰潜伏期也缩短。EOG曲线变得更为弯曲，某些EOG的参数（如Arden比和G比值）也明显的增加。用棋盘格翻转刺激中央6度视野时能够记录到P-VEP的患者数目，45例中由术前的22例在术后增加到31例。45例的残存P100波的平均振幅由术前的1.007μV增加到术后的2.236μV，有显著的统计学意义。同年，Norman等[38]作了类似研究。对1例RP患者胚胎视网膜移植术进行了ETDRS视锐度，扫描激光眼底镜，供受体组织染色，荧光血管造影，mEOG,mVEP和临床检查。结果发现ETDRS：从术前的20/800增加到术后的20/400（7mo时），20/250（9mo时）和20/160（1a时）。单独在术后9mo进行了SLO视锐度检查，结果为40度视野内视锐度为20/270。研究证明ETDRS视锐度呈持续改善。
4结语
综上所述，视网膜移植已经取得了很多进展，但要获得长期稳定的疗效并推广应用，还有许多问题有待解决。视网膜移植通过视网膜前体细胞与局部微环境中的可溶性因子的相互作用，诱导前体细胞分化为感光细胞，为感光细胞变性提供一种可行的方法，但局部可溶性因子种类繁多，作用复杂，尚待进一步研究。如视网膜移植在临床上推广应用，则移植物的来源也是一个问题，移植物的保存技术需进一步研究。视网膜移植对视力的影响不大，已有报道在人类行视网膜移植后患者视力提高，但只主观视力提高明显，客观视力无大变化。视网膜移植后，移植物与受体视网膜的整合，形成功能连接，但感光细胞移植后形成的新的突触并不多，不能完全替代原正常视网膜的功能。Berson等[39]认为，替代整个视网膜是超越现有能力的，通过神经把移植的网膜与大脑联系起来是不可能的。但在不干扰视网膜神经组织的情况下刺激更多的突触形成则是未来研究要针对的问题[7]。RP的治疗方法较多，各有优缺点，如果两种或两种方法结合起来应用则能达到更好的效果。视网膜移植作为治疗RP的最佳方案，与其他疗法相结合能够获得更好的疗效。视网膜移植的研究应与RP疾病的研究及其他疗法的研究共进。
【】
1 Bowne SJ, Daiger SP, Hims MM, Sohocki MM, Malone KA, McKie AB, Heckenlively JR, Birch DG, Inglehearn CF, Bhattacharya SS, Bird A, Sullivan LS. Mutations in the RP1 gene causing autosomal dominant retinitis pigmentosa. Hum Mol Genet ,1999;8(11):2121-2128
2 Pleyer U. Gene therapy in hereditary retinal degeneration and the tower of Babel. Br J Ophthalmol ,2001;85(3):255-256
3 Reh TA, McCabe K, Kelley MW, Bermingham-McDonogh O. Growth factors in the treatment of degenerative retinal disoreders. Ciba Foumd Symp ,1996;196:120-131, discussion 131-134
4 Gouras P, Flood MT, Kjedbey H, Bilek MK, Eggers H. Transplantation of cultured human retinal epithelium to Bruch's membrane of the owl monkey's eye. Curr Eye Res ,1985;4(3):253
5 Das TP. Neural retinal transplantation in RP patients; result sofa long-term safety study. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1998;39:458
6 Santos A, Humayun MS, de Juan E Jr, Greenburg RJ, Marsh MJ, Klock IB, Milam AH. Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa A morphometric analysis. Arch Ophthalmol ,1997;115(4):511-515
7 Ghosh F, Wong F, Johansson K, Bruun A, Petters RM. Transplantation of full-thickness retina in the rhodopsin transgenic pig. Retina ,2004;24(1):98-109
8 Gouras P, Du J, Kjeldbye H, Yamamoto S, Zack DJ. Reconstruction of degenerate rd mouse retina by transplantation of transgenic photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1992;33(9):2579-2586
9 Silverman MS, Hughes SE. Transplantation of photoreceptors to light-damaged retinal. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1989;30(8):1684-1690
10 Seiler MJ, Aramant RB, Bergstrom A. Co-transplantation of embryonic retina and retinal pigment epithelial cells to rabbit retina. Curr Eye Res ,1995;14(3):199-207
11 Chacko DM, Das AV, Zhao X, James J, Bhattacharya S, Ahmad I. Transplantation of ocular stem cells: the role of injury in incorporation and differentiation of grafted cells in the retina. Vision Res ,2003;43(8):937-946
12 Dunaief JL, Kwun RC, Bhardwaj N, Lopez R, Gouras P, Goff SP. Retroviral gene transfer into retinal pigment epithelial cells followed by transplantation into rat retina. Hum Gene Ther ,1995;6(9):1225-1229
13 Silverman MS, Hughes SE, Valentino TL, Liu Y. Photoreceptor transplantation:anatomic,electrophy siologic,and behavioral evidence for the functional reconxtruction of retinas lacking photoreceptor. Exp Neurol ,1992;115:87-94
14 Kaplan HJ, Tezel TH, Berger AS, Wolf ML, Del Priore LV. Human photoreceptor transplantation in retinitis pigmentosa. Arch Ophthalmol ,1997;115(9): 1165 -1172
15 Bergstrom A, Ehinger B, Wilke K, Zucker CL, Adolph AR, Aramant R, Seiler M. Transplantation of embryonic retina to the subretinal space in rabbits. Exp Eye Res ,1992;55(1):29-37
16 Lopez R, Gouras P, Brittis M, Kjeldbye H. Transplantation of cultured rabbit retinal epithelium to rabbit retina using a closed-eye method. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1987;28(7):1131-1137
17 DiLoreto DA Jr, del Cerro C, Lazar ES, Cox C, del Cerro M. Storage of human fetal retina in optisol prior to subretinal transplantation. Cell Transplant ,1996;5(5):553-561
18 Aramant R, Seiler M. Cryopreservation and transplantation of immature rat retina into adult rat retina. Brain Res Dev Brain Res ,1991;61(2):151-159
19 Yamaguchi K, Yamaguchi K, Gaur VP, Turner JE. Retinal pigment epithelial cell transplantation into aging retina: a possible approach to delay age-related cell death. Jpn J Ophthalmol ,1993;37(1):16-27
20 Little CW, Castillo B, DiLoreto DA, Cox C, Wyatt J, del Cerro C, del Cerro M. Transplantation of human fetal retinal pigment epithelium rescues photoreceptor cells from degeneration in the Royal College of Surgeons rat retina. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1996;37(1):204-211
21 Gouras P, Du J, Kjeldbye H, Yamamoto S, Zack DJ. Long-term photoreceptor transplantation in dystrophic and normal mouse retina. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1994;35(8):3145
22 Kaplan HJ, Tezel TH, Berger AS, Del Priore LV. Retinal transplantation. Chem Immunol ,1999;73:207-219
23 Ghosh F, Arner K. Transplantation of full-thickness retina in the normal porcine eye:surgical and morphologic/aspects. Retina ,2002;22(4):478-486
24 Radtke ND, Seiler MJ, Aramant RB. Transplantation of intact sheets of fetal neutral retina with its retinal pigment epithelium in retinitis pigmentosa patients. Am J Ophthalmol ,2002;133(4):544-550
25 Seiler MJ, Aramant RB. Transplantation of embryonic retinal donor cells labelled with BrdU or carrying a genetic marker to adult retina. Exp Brain Res ,1995;105(1):59-66
26 Diloreto DA Jr, Das T, Del Cerro C. Fluorescein as a marker for subretinal transplantation of human fetal neural retina. Curr Eye Res ,1997;16(11):1159-1165
27 Warncke B, Valtink M, Weichel J, Engelmann K, Schafer H. Experinental rat model for therapeutic retinal pigment epithelium transplantation-unequivocal microscopic identification of human donor cells by in situ hybridization of human-specific Alu sequences. Virchows Arch ,2004;444:74-81
28 Boulton M, Rozanowska M, Wess T. Ageing of the retinal pigment epithelium:implications for transplantation. Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol ,2004;242:76-84
29 Das T, del Cerro M, Jalali S, Rao VS, Gullapalli VK, Little C, Loreto DA, Sharma S, Sreedharan A, del Cerro C, Rao GN. The transplantation of human fetal neuroretinal cells in advanced retinitis pigmentosa patients:results of along-term safety study. Exp Neurol ,1999;157(1):58-68
30 Weisz JM, Humayun MS, De Juan E Jr, Del Ceero M, Sunness JS, Dagnelie G, Soylu M, Rizzo L, Nussenblatt RB. Allogenic fetal retinal pigment epithelial cell transplant in a patient with geographic atrophy. Retina ,1999;19(6):540
31 Blair JR, Turner JE. Optimum conditions for successful transplantation of immature rat retina to the lesioned adult retina. Brain Res ,1987;433(2):257-270
32 Sheedlo HJ, Gaur V, Li LX, Seaton AD, Turner JE. ransplantation to the diseased and damaged retina. Trends Neurosci ,1991;14(8):347-350
33 Gouras P, Tanabe T, Ultrastructure of adult rd mouse retina. Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol ,2003;241:410-417
34 Gouras P, Tanabe T. Survival and integration of neural retinal transplants in rd mice. Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol ,2003;241:403-409
35 Akagi T, Haruta M, Akita J, Nishida A, Honda Y, Takahashi M. Different characteristics of rat retinal progenitor cells from different culture periods. Neurosci Lett ,2003;341(3):213-216
36 Radtke ND, Aramant RB, Seiler M, Petry HM. Preliminary report: indications of improved visual function after retinal sheet transplantation in retinitis pigmentosa patients. Am J Ophthalmol ,1999;128(3):384-387
37 Tsai HJ, Yang CH, Pang XJ. Surgical therapy in 45 patients with retinitis pigmentosa. Int J Ophthalmol(GuojiYanke Zazhi) ,2004;4(1):39-44
38 Radtke ND, Aramant RB, Seiler MJ. Vision change after sheet transplant of fetal retina with retinal pigment epithelium to a patient weth retinitis pigmentosa. Arch Ophthalmol ,2004;12(2):1159-1163
39 Berson EL, Jakobiec FA. Neural retinal cell transplantation: ideal versus reality. Ophthalmology ,1999;106:445
