促红细胞生成素对视神经视网膜的保护作用
【摘要】 促红细胞生成素（Erythropoietin, EPO）主要作用于骨髓巨核前体细胞，刺激红系造血祖组织及早幼红细胞形成成熟的红细胞集落。近年来，大量的研究显示EPO和EPO受体在神经系统上有功能表达，在体外培养及动物试验中都显示了显著的神经保护功能。在眼科，青光眼、视网膜脱离、视网膜色素变性等疾病的共同病理机制是视网膜神经节细胞、光感受器细胞等神经元的凋亡，最终导致视力的丧失。因此，EPO的神经保护作用对这些疾病有一定的实际意义。现了EPO的神经保护性质分子机制及信号传导途径，探讨EPO用于青光眼视神经保护治疗的基础和可能性。
【关键词】 促红细胞生成素 神经保护 凋亡 信号转导 青光眼 视网膜神经节细胞
1 EPO的生物功能
促红细胞生成素（erythropoietin, EPO）是分子量约为30~39ku的糖蛋白，以前认为它主要是调节红细胞的生成的造血细胞因子，产生于胎儿的肝脏和成人的肾脏。EPO和它的受体（erythropoietin receptor, EPOR）主要存在于骨髓的造血干细胞并刺激它向红细胞分化。EPO的造血作用主要是抑制红系前体细胞的凋亡，促进它向红细胞的增殖和分化[1]。红细胞生成可以进一步改善组织的氧供，同时，组织氧供又作为一种关键的激素反馈机制，是EPO产生和造血功能的主要调节器。
EPO在1985年从再生障碍性贫血患者的尿液中分离出来，并成功克隆[1]，在哺乳动物细胞中获得表达。不久，重组EPO获得成功，在晚期肾病患者中进行临床试验及评估。1989年美国食品与药品管理局（FDA）正式批准EPO在临床应用。现在它已经广泛应用于肾衰、癌症、早产、慢性炎症和HIV感染所致的贫血[1]。
很多年来，EPO一直被认为只能作用于红系前体细胞，然而，许多研究显示EPO除了造血功能外，还有许多潜在作用，证据之一就是EPO和它的受体在不同组织中都有表达，包括神经系统[2-4]。EPO也并不只是只由胎儿肝脏和成人肾脏分泌产生，在神经系统内，不同的细胞形态（包括神经元、胶质细胞和内皮细胞）都产生和表达EPO和EPOR。Masuda等首先在鼠胚胎18d脑组织的体外培养中用 Southern杂交和免疫化学染色方法发现了神经细胞自身分泌的EPO，且与肾源性EPO结构相同，在脑组织中同样有EPO存在并对神经元有旁分泌作用。近10a来，大量的实验研究显示EPO不论在细胞培养和神经系统疾病的动物模型中都显示了显著的神经保护作用。
2 EPO和EPOR在神经系统中的表达
以前认为EPO只作用于造血系统，然而，目前的研究显示在许多人类和动物模型中器官组织细胞都有功能性EPOR的存在，这些非造血细胞包括内皮细胞[5,6]、肠上皮细胞[7,8]、肌肉[9-12]、胎盘组织，以及神经系统中神经元和非神经元细胞。由于EPO是通过活化特定的EPOR而发挥作用。弄清EPOR在中枢神经系统中的分布有助于我们了解EPO的生物功能。EPO和EPOR在啮齿类、灵长类及人类的神经系统中都有功能性表达，脑源性EPO和它的受体在结构、功能及调节与其他组织分泌EPO的差别已经明确[13]，脑源性EPO与血浆EPO相比，脑源性EPO更小更有活性，这种区别具体机制不清。
2.1鉴定EPOR的方法 ①放射性碘化EPO进行结合试验[3]。②逆转录聚合酶链式反应分析（RT-PCR）。③细胞免疫染色[14]，EPOR受体在啮齿类、灵长类及人类的神经系统中已被鉴别出来，集中在原代神经元细胞系和胶质细胞上。此外，神经元和胶质细胞对EPO的免疫组化反应阳性[14]，提示在神经系统中这些细胞参与了EPO的合成和生产。
2.2 EPOR在神经系统中的表达 在活体外试验中发现表达EPOR的神经元和胶质细胞有：大鼠海马和大脑皮质神经元[14]；大鼠海马神经元[15]； P12大鼠嗜铬细胞瘤细胞[16]；SN6间隔胆碱能细胞[17]；人类神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的培养物[4]；大鼠的少突胶质细胞[18]；Wistar大鼠视网膜的外丛状层、光感受器内节、神经节细胞层、内丛状层[19]；大鼠视网膜的神经节细胞[20]。EPOR在原位的表达：成年小鼠的海马、内囊、皮质、中脑[3]；灵长类动物大脑海马、扁桃体、颞侧皮质[21]；人类大脑海马、扁桃体、小脑、颞侧皮质[21]；妊娠前6mo的脊髓组织[18]；人类胎儿[22]；大鼠视网膜神经节细胞胞体和树突、内核层、外核层[23]。
3神经系统中EPO和EPOR表达的调节
神经系统包括大脑，EPO基因表达主要受缺氧诱导因子1（HIF-1 调节EPO表达的转录因子）的调节，HIF受许多应激原而激活，包括缺氧[1]，在大脑和肾脏最明显，而在子宫EPOmRNA只有在雌激素存在下才能表达。因此，EPO是以组织特异性的方式表达，有证据表明星形胶质细胞EPO的表达在mRNA水平上主要受缺氧水平的调节，缺氧可以大大加速其表达[16]。在海马神经元培养中，缺氧可以诱导EPO和EPORmRNA的表达[24]。大鼠神经元培养中缺氧大大促进EPOmRNA的表达，而亚胺环已酮（一种蛋白合成抑制剂）可以完全阻断这种作用[25]。所以，类似于肝瘤细胞系和肾脏中已被鉴别出来的一种氧气传感系统，可能控制了星形胶质细胞和神经元表达EPOmRNA。在活体内缺氧也可诱导EPORmRNA的表达，缺氧条件下，大鼠海马区的EPOmRNA的表达也增加[26]，EPO增量调节的时间在脑和肾脏不同，在鼠的肾脏持续缺氧2h，EPOmRNA表达达高峰，8h后下降至最高值的30%。而相反，在脑内缺氧刺激4h EPOmRNA表达达顶峰，并持续24h[27]。薛文等[28]发现EPO在无损伤脊髓中即有少量表达，缺血再灌注损伤后8h表达显著上调。在缺氧预处理的条件下，大鼠视网膜EPO表达增加[29]。
3.1其他影响神经系统中EPO和EPOR表达的因素 缺氧可能不是刺激大脑EPO产生的唯一因素，另外一些代谢紊乱，如低血糖或强烈的神经元去极化产生的线粒体活性氧簇，都可以通过HIF-1的活化增加脑内EPO的表达[27]。胰岛素和胰岛素样生长因子可以刺激培养的星形胶质细胞表达EPOmRNA并呈剂量依赖性。胰岛素和胰岛素样生长因子在中枢神经系统内大量表达，但它对脑内EPO产生的刺激作用的生理重要性并不清楚[2]。在活体外，在暴露炎症因子如白介素-1β、白介素6及肿瘤坏死因子（TNF-α）[4]后，星形胶质细胞EPO表达下降。在缺血性视网膜病变（如增殖型糖尿病性视网膜病变和视网膜分支静脉闭塞等）玻璃体腔内EPO的浓度大量增加[30]，研究者认为对缺血性视网膜病变来说，EPO可能是一种神经保护因素。
3.2神经系统受损后EPO和EPOR表达的变化 缺氧可以诱导EPO和EPOR表达增加，提示EPO在中枢神经系统可能作为一种神经营养因子和神经保护因子，特别是在神经损伤的情况下例如缺氧、缺血或大脑出血等情况。有报道在局部缺血损伤下大脑组织EPOR基因表达增加，大脑中动脉闭塞后的缺血半影区EPOR表达增加[31]。在正常人的大脑，EPO/EPOR免疫反应主要在神经元[32]。在急性缺血损伤中，血管、神经元、星形胶质细胞EPOR表达上调；在陈旧性缺血性梗塞中，有活性的胶质细胞表达仍然增加（中风后>18d）；在新鲜的缺血性梗塞中，血管内皮细胞显示EPO免疫反应；在微血管和神经纤维上显示了EPOR免疫反应性。在人类缺血缺氧性脑损伤中EPO/EPOR大量增加，强调了他们是一种内源性的神经保护系统。另外一些应激原如癫痫发作，也可以刺激大脑微血管内EPOR表达大量增加[33]。
4 EPO的神经保护作用
从神经心理测试和电生理评估情况看，重组EPO的治疗有益于大脑功能恢复[34]。这种改善与红细胞增加，脑内缺氧状态得到纠正有关。有报道称由于贫血改善，红细胞容积恢复正常，神经认知能力得到进一步的改善[35]。同时，已有活体及体外培养试验显示EPO可能有直接的神经营养和神经保护作用。
4.1活体外试验 越来越多证据表明，与其它血细胞生成因子一样，EPO与中枢神经系统有联系，它们作用于中枢胆碱能神经元，作为一种神经营养因子，影响其分化、存活和再生[36]。EPO保护神经元初级培养物免受谷氨酸神经毒性作用，并且呈剂量依赖性。细胞预处理8h后，保护作用达到最高值，这提示RNA和蛋白质合成对于这种保护是必须的[14]，并且用可溶性的EPOR中和内源性的EPO后，可以阻止EPO对谷氨酸毒性的保护作用。EPO分子神经营养氨基酸序列（17分子）已被分离出来，这部分序列在可以增加大鼠NSZOY和人类SK-N-MC成神经瘤细胞株的胆碱已酰基转移酶的活性，阻止细胞死亡，但并不刺激老鼠原代脾细胞株或红细胞生成细胞株的增殖[37]。如果加用EPOR胞外域抗体的话，可以阻断这种作用，由此证明此作用是EPOR调节的，EPO能保护培养的神经元细胞免受死亡，但不能保护神经胶质细胞[38,39]。EPO对人神经母细胞瘤细胞有相同作用[18]，EPO可以刺激啮齿类动物皮质神经元的存活能力[40]。还可以促进大鼠少突神经胶质经细胞的分化和成熟[18]。这些发现说明EPO可能影响少突胶质细胞，使之促进正常或受损的成熟CNS髓鞘的修复。在眼视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cells RGCs）培养中，证明EPO可以保护RGCs免受谷氨酸和氧化亚氮的细胞毒性作用[19]，使用EPO可以阻止神经营养因子去除后的免疫纯化的RGCs的死亡[23]，EPO还可以促进RGCs的生长。
4.2活体内试验 已经有许多神经系统损伤的模型（小鼠、沙土鼠、兔等）证明了EPO作为神经保护剂的有效性。包括大脑和脊髓缺血模型[41-49]、蛛网膜下腔出血模型[46,50]等。由于视网膜是中枢神经系统的一个延伸，目前研究认为EPO对眼的视网膜也有保护作用。
通过升高眼内压而引起暂时性的视网膜缺血，在缺血前或缺血后立即全身给予EPO治疗可以减少组织病损伤和细胞凋亡，通过视网膜电流图检查发现还可以促进其功能恢复。用可溶性的EPOR中和内源性的EPO后，反而加剧视网膜缺血损伤，这说明EPO/EPOR系统对于缺血损伤后神经元的存活和恢复有重要作用。在成年鼠视网膜光损伤模型中，全身应用EPO可以通过血一视网膜屏障并阻止细胞凋亡[51]。
在青光眼和一些眼病中， RGCs的死亡，导致视功能的进行性丧失，神经保护治疗对于阻止RGCs的死亡就显得相当重要，在轴索切断后的大鼠视神经损伤模型中，EPO可以提高RGCs的存活率[23]。在大鼠青光眼模型中，玻璃体腔内注射EPO，与生理盐水及空白对照组相比，RGCs的数目没有明显的减少[52]。把大鼠的视网膜放在不同浓度的葡萄糖液中培养发现，EPO在低浓度糖中对神经元有保护作用，在高浓度糖中没有作用，作者推测糖尿病患者中的EPO作用减弱可能参与了糖尿病视网膜病变的发生[53]。也有研究认为EPO对光诱导的或是先天性视网膜变性动物模型（rds）有保护作用[54]。在缺氧情况下，EPO可以减少光感受器细胞的凋亡[29]。Junk证明EPO通过抗凋亡机制可以对RGCs缺血再灌注损伤有保护作用。
不过，EPO对视网膜的保护作用也不是万能的，有研究 [31] 认为EPO对遗传性色素性视网膜变性没有保护作用，并认为这可能是急性光诱导的光感受器细胞的死亡机制与遗传性色素性视网膜变性不同所致。
5神经保护的作用机制
EPO的神经保护作用的机制并不完全清楚，有多种机制可以解释EPO对神经元的保护作用。EPO受体属于细胞因子受体超家庭成员，这些受体本质上都与信号的转导有关，EPO在神经系统内的传导机制可能与红细胞生成的机制相同，EPO与EPO受体结合使受体形成二聚体，JAK2发生自身磷酸化反应和受体活性，JAK2的激活导致几个下游的信号转导途径被激活，包括Ras-MAPk、PI（3）K和STAT-5。EPO受体受刺激通过效应可引起相应靶细胞的增殖，抑制凋亡，以及分化作用，受体通过SHP-1脱磷酸化而失活[55]。这些途径对EPO的神经保护作用也是关键的。因此 MAPK和PI（3）K的特异性抑制剂能明显减弱EPO对缺氧导致神经细胞死亡的保护作用，EPO活化EPOR增强MAPK磷酸化，诱导JAK-2酪氨酸磷酸化[56]，另外一些生长因子（如BDNF和VEGF）的细胞保护作用也牵涉到这些信号机制。神经元内JAK2、STAT-5和NFκB信号转导系统的相互作用最近已被证明[57]。EPO能产生剂量依赖性的核内NFκB升高，胞浆内NFκB降低，这与它的神经保护作用相一致，JAK2磷酸化对NFκB的核转运是必需的，对EPO的神经保护作用也是必需的[57]，但是在红细胞内EPO所诱导的NFκB激活并不依赖JAK2途径。JAK2和NFκB的信号转导系统的相互影响已有报道[57]，通过这条途径，EPO可以防止兴奋性中毒和一氧化氮诱导的神经元的凋亡。通过JAK-2显性负相过度表达或IκB抑制剂或NFκB易位抑制剂可以阻断EPO的神经保护作用,神经元内NFκB通过Akt-1的活化，Bad磷酸化和Bcl-XL上调而起到抗凋亡作用，Akt也被PI（3）K激活，而MAPK和STAT-5使Bcl-XL上调。Akt活化后稳定线粒体膜电位阻止细胞色素C的释放，从而保护神经元[58]，细胞色素C从线粒体释放可使Caspase家族活化，使细胞死亡，DNA断裂，神经膜外部分的磷脂酰丝氨酸暴露。在一个氧自由基损伤模型中，EPO通过增加Akt-1活性，进而调节线粒体膜电位细胞色素C释放和Caspase-1,3，8活性来防止神经元膜上磷脂酰丝氨酸的暴露和DNA断裂[15]。
EPO还可调节促进抗凋亡分子的基因表达，从而起到神经保护作用[59]，在一些试验模型中，EPO需要一个较长的时间来诱导基因表达程序。近来，有研究指出，EPO可以促进BDNF的mRNA表达和具有生物活性的BDNF产生（在初级海马神经元培养），从而长期活化特异性受体TrKB，当BDNF被特异性抗体中和后，可以降低EPO的神经保护和TrKB磷酸化作用，这证明BDNF和TrKB也参与EPO的神经保护作用，大鼠脑室内注入EPO也可以诱导BDNF的表达[60]。
EPO可以促进神经元内Ca2+增加，这是EPO神经保护作用很重要的步骤，而电压依赖式Ca2+通道的活化、Ca2+敏感转录因子的募集可以诱导神经元BDNF的表达。实际上，EGTA（钙离子螯合剂）或钙离子通道抑制剂可以阻断EPO的保护作用（在谷氨酸毒性[50]或生长因子去除的情况[14]）。细胞内Ca2+增加可以调节NFκB 、PI（3）/Akt和MAPK和STAT-5的活性。EPO的另外一个神经保护的特点就是抑制白细胞的浸润和抑制促炎症细胞因子，如TNF IL-6和MCP-1[61]，由于炎症可以使神经元进一步损伤。因此，EPO的神经保护作用也可能是减轻炎症反应所致，然而，在人类单核细胞和老鼠神经胶质细胞的体外培养中，EPO并不能抑制肿瘤坏死因子（TNF）的产生[61]。在选择性神经毒剂处理的胶质细胞和神经元混合培养物中，EPO减少了TNF-α的产生，在培养基中，胶质细胞可被濒死神经元活化[62]，这说明EPO具有不直接的抗炎活性是由于它减少了神经元的死亡所致。
另外，EPO的神经保护作用还包括促进血管生成[63]和神经营养[64]，及促进神经生长的作用[65]。
在眼视网膜神经节细胞培养中，EPO神经保护机能可能与上调Bcl-2和Bcl-XL基因有关[19]。
另外有一些研究对保护机制有不同意见，在tg21转基因鼠轴索切断模型的研究发现tg21与野生型相比较，前者对RGCs有保护作用，研究还发现起保护作用的可能是ERK-1/-2和AKt及下降的Caspase-3，与STAT-5 和Bcl-XL无关。可能确切的机制还需要进一步的研究。6总结
从本文综述的细胞培养和动物实验的结果看，可以肯定EPO有神经保护作用。在各种原因引起的中枢神经系统疾病中，神经保护就是一个阻止神经元的凋亡的工具，是一种新的治疗方法[66]。在生长因子的细胞培养和动物实验中，证实生长因子有利于神经元的存活和功能恢复，进而证明了神经保护是一种很好的治疗方法。但是这些生长因子在动物实验中所发现的毒性限制了他们在临床上的应用。rhEPO是一种耐受性良好的药物,已经在许多患者身上使用.并且已有证据显示其可以通过血-脑屏障和血-视网膜屏障[67],从而有可能作为一种神经保护药在临床上使用.
但如果作为神经保护药长期使用的话,EPO也有一些副作用,如血液粘滞性升高,血小板聚集,红细胞增多，血压增高等[68]。EPO的促红细胞的生成、神经保护及血管生成素活性功能的抗原决定簇的识别和分离，rhEPO的衍生物，使之只有神经保护作用而没有促红细胞生成的作用将有利于EPO在神经系统疾病中,包括眼科疾病的长期使用。有研究者将rhEPO酶解成asialoEPO，有神经保护功能而没有促红细胞生成的作用[69]。对于眼科来说，我们还可以将EPO用于局部治疗来减轻它的副作用[70]。
总之，EPO可作为一种新的神经保护药物，但对EPO应用于眼科临床还需要更进一步的研究。
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