淋巴结阴性乳腺癌患者骨髓细胞角蛋白检测及意义

               作者：陈龙舟，王水，赵佳，王风良

【摘要】  ［目的］ 探讨采用免疫细胞化学（ICC）和RT-PCR方法同时检测腋淋巴结阴性乳腺癌（axillary lymph nodes negative breast cancer，ALNNBC）患者骨髓微小转移的意义。［方法］ 对常规HE染色腋淋巴结阴性的62例乳腺癌患者采用免疫细胞化学（ICC）和RT-PCR方法检测骨髓细胞角蛋白CK19的表达情况。［结果］ ICC法检出CK19阳性表达率为14.52%（9/62），而RT-PCR方法检测则CK19阳性表达率为24.20%（15/62），两者差异有统计学意义（χ2=4.1667，P=0.0412）。［结论］ 常规病理检查腋淋巴结阴性的乳腺癌患者，用ICC法和RT-PCR法对其骨髓血作进一步检测，可以发现微小转移的存在，RT-PCR方法比ICC更敏感。

【关键词】  乳腺肿瘤

    Detection of Cytokeratin in Bone Marrow in Breast Cancer Patients with Negative Axillary Lymph Nodes and its Significance

     Abstract: ［Purpose］ To investigate the significance of concurrent detecting cytokeratin in bone marrow with immunocytochemistry (ICC) and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) for breast cancer with micrometastases in bone marrow. ［Methods］ The expression of cytokeratin 19 (CK19) in bone marrow was detected by ICC and RT-PCR in 62 patients with negative axillary lymph nodes from HE-staining sections. ［Results］ The expression of CK19 was 14.52%(9/62) by ICC method, and 24.20%（15/62） by RT-PCR. The results were significantly different between the two methods（χ2=4.1667，P=0.0412）. ［Conclusion］ Even there is no axillary lymph nodes involvement in routine pathological examination, micrometastases could be detected in bone marrow by ICC and RT-PCR. RT-PCR is superior to ICC.

    Key words: breast neopalsms; micrometastases; bone marrow; cytokeratin

    侵袭和转移是导致乳腺癌失败的主要原因。国内外对骨髓微小转移的研究显示，骨髓中长期存在肿瘤细胞是复发和转移的重要原因之一[1~5]，腋窝淋巴结阴性乳腺癌（ALNNBC）患者骨髓微小转移的检测，对于判断预后和指导治疗具有潜在价值。本研究采用免疫细胞化学（immunocytochemistry，ICC）和RT-PCR联合的方法同时检测ALNNBC骨髓的微小转移，探讨其临床意义。

    1   材料与方法

    1.1   一般资料

    2004年6月至2006年12月，南京医科大学第一附属及淮安市妇幼保健院乳腺外科收治的女性乳腺癌患者，经病理检查确诊且腋淋巴结无转移者共62例， 所有患者术前行胸部X线片、肝脏B超和全身骨显像等检查未发现远处转移，临床分期Ⅰ~Ⅱ期，年龄29~76岁，平均52.47岁。

    1.2   骨髓标本收集

    所有患者均签署知情同意书，病人全身麻醉后取胸骨体作为穿刺部位，穿刺前抽取病人骨髓血5ml，肝素抗凝混匀，立即送实验室作进一步处理。

    1.3   免疫组化检测

    采用链酶亲和素—生物素—过氧化物酶复合物，标志物为细胞角蛋白（cytokeratin，CK19），抗CK单克隆抗体购自丹麦Dako公司，按试剂盒说明书要求进行操作。光学显微镜下观察检测结果，CK19阳性细胞被染成棕色，分布于细胞浆或细胞膜上。骨髓微小转移的诊断以有CK阳性细胞为依据。

    1.4   RT-PCR检测方法

    1.4.1   引物设计

    KT-19引物[4](上海申能博彩公司合成)：上游5′-ATT CCG CTC CGG GCA CCG ATC T-3′，下游：5′-CGC TGA TCA GCG CCT GGA TAT GCG-3′；扩增产物片段长度为351bp，内参采用GAPDH(上海申能博彩公司合成)，其序列为：上游：5′-GGA GCC AAA CGG GTC ATC ATC TC-3′，下游：5′-GAG GGG CCA TCC ACA GTC TTC T-3′，扩增产物长度为250bp。

    1.4.2   单个核细胞分离和RNA提取

    取得骨髓标本后立即用生理盐水稀释成2倍，缓慢加入含4ml人淋巴细胞分离液（ficoll）的离心管中，4℃下2 000r/min离心20min使标本分层，吸出中间的单个核细胞（白膜层），将分离出的单个核细胞用PBS液洗涤1次后加入1ml Trizol（Invitrogen，美国），再加入200μl氯仿，室温振荡15s，4℃离心15min，取上清液加入等体积异丙醇，4℃离心10min，弃上清，加入1ml预冷的75%乙醇（DEPC水配制），震荡混匀后，4℃离心5min，弃上清，用30μl DEPC水溶解，-70℃保存。采用分光光度计检测RNA的纯度及浓度。

    1.4.3   RT-PCR扩增

    逆转录试剂盒采购于Promega公司，按试剂盒说明书操作。PCR反应体系为：cDNA 2μl，50mM Mg2+ 1μl，10×M-MLV反应缓冲液2μl，TaqDNA酶0.2μl（5U），上下游引物各2.5μl（20pmol/L），10mM dNTPs 0.5μl，补充双蒸水至终体积25μl。PCR反应条件：预变性，94℃ 5min；变性，94℃ 45s；退火，58℃ 45s；延伸，72℃ 45s，40个循环，最后72℃ 10min。电泳：PCR产物8μl上样于2％琼脂糖凝胶，紫外透析灯对凝胶进行摄影。

    1.5   统计学分析

    采用SPSS 10.0 McNemar-χ2检验、Kappa一致性检验和χ2检验。检验水准α=0.05。

    2   结   果

    2.1   CK19在乳腺癌中的表达

    免疫细胞化学方法(ICC）检测CK19的表达: ICC法检测CK19阳性9例，CK19阴性53例，阳性率为14.52%。

    RT-PCR方法检测CK19 mRNA的表达：RT-PCR扩增产物为351bp特异性条带，以GAPDH为内参照，所有mRNA都可扩增出250bp的GAPDH条带，说明mRNA没有降解。本实验PCR反应体系的检测敏感度可达到10-6，RT-PCR检测CK19 mRNA阳性表达15例，阳性率为24.20%（见图1）；ICC法检测CK19阳性的9例，CK19 mRNA均为阳性表达。

    RT-PCR和ICC检测骨髓微小转移检出率的比较和一致性分析见表1，kappa=0.6945；χ2=4.1667，P=0.0412（McNemar-χ2-test）。

    2.2   骨髓微小转移与临床生物学特性关联性分析

    骨髓微小转移与肿瘤大小、病理类型、激素受体状况、Her-2、p53及年龄等因素之间的关系,通过统计学分析,仅发现CK19 mRNA骨髓表达率和原发肿瘤大小之间有关联性(χ2=8.744，P=0.003)(见表2)。

    3   讨   论

    ALNNBC患者预后良好，但同样具有异质性，不同的病例其肿瘤浸润和转移的倾向不同，有30%在术后10年内出现复发和转移[6]。术后辅助对某些ALNNBC可以获益，但是，如果全部接受辅助治疗，可使许多患者承受过度治疗的痛苦。骨髓由于自身解剖特点而易于浓缩肿瘤细胞，是乳腺癌远处转移最常见的部位，骨髓微小转移的检测及其临床价值成为国内外研究的热点[7，8]。

    细胞角蛋白（cytokeratin，CK）是细胞骨架的组成成分，在上皮来源的组织中呈特异性分布，非上皮来源组织（如骨髓）中不表达，因而把细胞角蛋白作为乳腺癌患者癌细胞入骨髓的标志，其中CK19在乳腺癌中的特异性和敏感性最高[9]，临床上常将CK19作为标志物用于乳腺癌淋巴结、骨髓和外周血微小转移的检测。本组62例乳腺癌骨髓标本均采用ICC和RT-PCR两种方法同时检测，ICC法发现9例（14.52%）阳性，而骨髓中CK19 mRNA表达率上升至24.20%（15/62），9例ICC阳性的病例CK19 mRNA检测均为阳性，两者检出率有统计学差异（χ2=4.1667，P=0.0412），结论与Schoenfeld 等[10]报道一致，说明RT-PCR方法比ICC敏感，RT-PCR法对传统的免疫组化方法是一个很好的补充，可以明显提高乳腺癌患者微小转移的检出率。

    本组对骨髓微小转移率与上述临床生物学特性进行关联性分析，结果显示仅肿瘤大小与骨髓CK19 mRNA表达率有关联(χ2=8.774，P＝0.003)，说明肿瘤大小是较强的预后因素。

    以上研究说明，免疫细胞化学法（ICC）和RT-PCR法均为乳腺癌骨髓微小转移检测的有效方法，RT-PCR方法比ICC更加敏感。尽管有许多研究认为骨髓微小转移与不良预后有关[11，12]，但通过这些敏感方法发现的微小转移对预后的影响尚存在很多争议，需要大样本的长期观察。

【】
  [1] Gebauer G, Fehm T, Merkle E, et al. Epithelial cells in bone marrow of breast cancer patients at time of primary surgery: clinical outcome during long-term follow-up[J]. J Clin Oncol, 2001, 19(16):3669-3674.

[2] 查小明, 范萍, 王水, 等. 骨髓与外周血中角蛋白19与乳腺癌微小转移的关系[J]. 中华外科杂志, 2001, 39（5）:382-384.

[3] Traweek ST, Liu J, Battifora H. Keratin gene expression in non-epithelial tissues. Detection with polymerase chain reaction[J]. Am J Pathol, 1993, 142(4):1111-1118.

[4] Balducci1 E, Azzarello1 G, Valori1 L, et al. A new nested primer pair improves the specificity of CK-19 mRNA detection by RT-PCR in occult breast cancer cells[J]. Int J Biological Markers, 2005, 20(1):28-33.

[5] Ikeda N, Miyoshi Y, Motomura K, et al. Prognostic significance of occult bone marrow micrometastases of breast cancer detected by quantitative polymerase chain reaction for cytokeratin 19 mRNA[J]. Jpn J Cancer Res, 2000, 91(9):918-919.

[6] Sakorafas GH, Geraghty J, Pavlakis G. The clinical signi ficance of axillary lymph node micrometastases in breast cancer[J]. Eur J Surg Oncol, 2004, 30(8):807-816.

[7] Roodman GD. Mechanisms of bone metastasis[J]. N Engl J Med, 2004, 350(16):1655-1664.

[8] Choesmel V, Pierga JY, Nos C, et al. Enrichment methods to detect bone marrow micrometastases in breast carcinoma patients: clinical relevance[J]. Breast Cancer Res, 2004, 6(5):R556-570.

[9] Stathopoulou A, Mavroudis D, Perraki M, et al. Molecular detection of cancer cells in the peripheral blood of patints with breast cancer: comparison of CK-19, CEA and maspin as detection markers[J]. Anticancer Res, 2003, 23(2C):1883-1890.

[10] Schoenfeld A, Kruger KH, Gomn J, et al. The detection of micrometastases in the peripheral blood and bone marrow of patients with breast cancer using Immunocytochemistry and reverse transcriptase polymerase chain reaction for keratin 19[J]. Eur J Cancer, 1997, 33(6):854-861.

[11] Braun S, Pantel K, Muller P, et al. Cytokeratin positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage Ⅰ, Ⅱ, or Ⅲbreast cancer[J]. N Engl J Med, 2000, 342(8):525-533.

[12] Ooka M, Tamaki Y, Sakita I, et al. Bone marrow micrometastases detected by RT-PCR for mammaglobin can be an alternative prognostic factor of breast cancer[J]. Breast Cancer Res Treat, 2001, 67(2): 169-175.